依达拉奉对癫痫持续状态大鼠神经元凋亡及XIAP、Caspase—3表达的影响

齐登斌 郭振元 闫波 张蕊

[摘要] 目的 探討自由基清除剂依达拉奉对于大鼠癫痫持续状态后所导致的神经元凋亡和XIAP、Caspase-3的影响。方法 对2015年9月—2017年9月雄性Wistar大鼠共54只展开研究，将该组所有大鼠随机分为对照组（N组）、模型组（M组）和依达拉奉组（ED组）3组，其中对照组6只，后两组再分为6、12、24、48 h 4个亚组，每个亚组6只。采用氯化锂-匹罗卡品制备SE动物模型，大鼠海马神经元凋亡检测采用TUNEL法来完成，同时对XIAP、Caspase-3蛋白表达采用免疫组化来进行检测。结果 在6 h内SE后M组主要有阳性TUNEL、XIAP和Caspase-3细胞，TUNEL和Caspase-3表达高峰是在24 h左右（43.17±1.424），（35.26±1.428）；XIAP表达高峰在12 h（40.68±2.817），两组差异有统计学意义（P=0.013）。ED组与M组相比，在12、24 h和48 h，TUNEL和Caspase-3阳性细胞数减少（P<0.05），XIAP阳性细胞数有所增加（P<0.05）。结论 依达拉奉在大鼠神经元凋亡下持续癫痫状态中应用，可以提高XIAP蛋白的表达，抑制Caspase-3蛋白的表达，从而对神经元损伤提供保护。

[关键词] 依达拉奉；大鼠；癫痫持续状态；XIAP；Caspase-3

[中图分类号] R5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2019）01（c）-0023-03

Effects of Edaravone on Neuronal Apoptosis and Expression of XIAP and Caspase-3 in Rats with Status Epilepticus

QI Deng-bin1， GUO Zhen-yuan1， YAN Bo2， ZHANG Rui3

1.Department of Neurology， Yanzhou District People's Hospital， Jining Medical College， Jining Medical College， Jining， Shandong Province， 272200 China；2.Shandong Sino-US Translational Medicine Cooperation Research Center， Jining， Shandong Province， 272200 China； 3.Affiliated Hospital of Jining Medical College （Pediatrics Department），Jining， Shandong Province， 272200 China

[Abstract] Objective To investigate the effects of free radical scavenger edaravone on neuronal apoptosis and XIAP and Caspase-3 induced by epilepticus in rats. Methods A total of 54 male Wistar rats from September 2015 to September 2017 were enrolled. All rats in this group were randomly divided into control group （N group）， model group （M group） and edaravone group （ED group）， there were three groups， including 6 in the control group. The latter two groups were subdivided into four subgroups of 6 h， 12 h， 24 h and 48 h， with 6 in each subgroup. The animal model of SE was prepared by using lithium chloride-pilocarpine. The apoptosis of rat hippocampal neurons was detected by TUNEL method. The expression of XIAP and Caspase-3 protein was detected by immunohistochemistry. Results After 6 hours， the main group had positive TUNEL， XIAP and Caspase-3 cells peak expression of TUNEL and Caspase-3 was about 24 h （43.17±1.424），（35.26±1.428）； the peak of XIAP expression was 12 h （40.68±2.817）， the different was statistically significant（P=0.013）. Compared with the M group， the number of TUNEL and Caspase-3 positive cells decreased in the ED group at 12 h， 24 h and 48 h （P<0.05）， and the number of XIAP positive cells increased （P<0.05）. Conclusion The application of edaravone in the continuous epilepsy state of rat neuronal apoptosis can increase the expression of XIAP protein and inhibit the expression of Caspase-3 protein， thus providing protection for neuronal damage.

[Key words] Edaravone； Rat； Status epilepticus； XIAP； Caspase-3

癫痫持续状态在临床医学中是一种常见的急症，会导致认知状态及行为状态发生急性或是持续性改变，从而导致大脑皮质、海马体等边缘神经元损伤。细胞凋亡的过程是一种程序性和自主性的过程，主要是受到基因调控，同时也是SE后神经元死亡重要形式之一。目前在抗凋亡效应中Caspase-3、XIAP对SE中的病理生理机制目前仍缺乏深入的研究。依达拉奉作为一种新型自由基清除剂，对迟发性神经细胞死亡及脂质过氧化反应具有抑制作用，该组对2015年9月—2017年9月54只大鼠癫痫持续状态治疗中采用依达拉奉，并对患鼠癫痫持续状态后神经元损伤情况，和对其自由基影响加以观察。

1 材料与方法

1.1 材料

取健康成年雄性Wistar大鼠54只，体质量为190～230 g，该组实验材料由济宁医学院附属医院实验动物中心提供，氯化锂、匹鲁卡品、依达拉奉由美國Sigma公司所提供。SOD试剂盒选购于南京建成生物公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 对该次的研究对象按照双盲法将其分为对照组（n=6）和实验组（n=48），其中实验组又分为依达拉奉治疗组（ED组）与模型组（M组），后两组再分为6、12、24、48 h 4个亚组，每个亚组6只。

1.2.2 动物模型建立 该组研究中所有动物均采用灌胃法，在造模前一刻钟ED组向腹腔注射50 mg/kg，依达拉奉（国药准字H20160151），M组与N组注射50 mg/kg，生理盐水。在造模后ED组与M组根据体质量指数注射127 mg/kg氯化锂，在20 h后向腹腔注射30 mg/kg匹罗卡品（国药准字H20013262）。对照组大鼠采用适量生理盐水向腹腔注射，观察大鼠在15～30 min后的癫痫发作状态，并给予地西泮（国药准字H33020250），终止癫痫发作。

1.2.3 标本处理方法 对各个时间点大鼠的状态进行观察，在给予1%的戊巴比妥钠麻醉后，在冰盘上取脑，将大鼠脑干和小脑快速去除，并将其置于0～4℃的生理盐水中进行漂洗，去除残留血液，并用滤纸进行擦拭干净，并取左侧称其质量，加入适量生理盐水，在冰浴中采用玻璃匀浆器制成脑匀浆，取上清液将其放置到冰箱中储藏，等待测定。右侧半脑采用多聚甲醛固定1 d，在石蜡包埋后，对其海马部位做一矢状切片，并对其采用免疫组织化学法对蛋白表达进行测定。

1.2.4 染色 按照试剂盒说明方法对 TUNEL进行染色，阳性细胞即凋亡细胞，将细胞核染为棕黄色颗粒。

1.2.5 XIAP、Caspase-3蛋白免疫组化检测 采用常规法进行免疫组化检测，每张切片取5个（×400倍）视野，测定各个视野阳性细胞数量，并取平均值进行计算。

1.3 统计方法

采用SPSS 13.6统计学软件对该组数据加以评定与总结，用χ2检验对计数资料进行检验，多样本均数用方差表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学观察

N组大鼠在治疗后无癫痫持续发作状态，采用匹鲁卡品向M组大鼠注射，待半小时后，大鼠均出现不同的症状，如点头、咀嚼等，部分大鼠出现站立、前肢痉挛等，同时会导致全身出现强直阵挛，上述症状反复发作，产生癫痫持续状态。ED组癫痫发作程度较轻，潜伏期长。

2.2 HE染色结果

正常对照组大鼠细胞呈椭圆形或圆形，核仁清晰，神经元排列整齐，胞浆透明，染色质分布均匀；模型组细胞排列紊乱，胞核固缩，胞浆红染，有嗜酸性神经元。依达拉奉组的嗜酸性神经元数量少，细胞排列较为松散，形态趋于正常。

2.3 细胞凋亡检测 N组大鼠阳性细胞表达较少

6 h时，M组大鼠SE后有TUNEL表达，主要分布在海马CA3区，阳性细胞核染色呈棕黄色，TUNEL阳性细胞表达少量，着色浅，随着时间的延长而不断增加，在24 h时达到表达高峰，在48 h时减少。ED组与M组两组在凋亡阳性细胞数变化上无显著差异，在24 h时TUNEL阳性细胞表达处于高峰，但细胞数量较M组少（P<0.05）。见表1。

2.4 XIAP及Caspase-3免疫组化结果

在12、24 h和48 h，ED组与M组XIAP和Caspase-3表达差异有统计学意义。见表2、3。

3 讨论

癫痫主要是由于多种因素所引起的一种慢性神经系统疾病综合征，由于大脑神经元异常，从而引起重复和短暂的神经功能失调，在癫病发展中自由基发挥着重要作用，根据研究发现，在癫痫时自由基是脑内异常代谢产物，并参与到癫病发展，加重脑损伤，损伤到线粒体，导致脑内神经元凋亡、兴奋性神经递质合成，进而产生疾病，在脑组织中具有较高的脂质含量，同时自由基会攻击脑内的不饱和脂肪酸，脂质会产生过氧化反应，产生大量过氧化物，同时又被分解成MDA产物，从而产生细胞代谢障碍，或导致脑实质功能产生障碍。在动物研究实验中发现，在癫痫发病中脑内MDA含量增加，下丘脑、脑垂体、海马体和脑皮层SOD活性降低，而癫痫发作次数的增加，这种变化也会随之发生显著变化。据研究观察与分析发行，大鼠癫痫持续状态下产生神经元凋亡，是由于有多种调控基因参与其中，受到基因调控所导致，而Caspase与XIAP则是当前在对凋亡调控基因中研究较多。

XIAP对Caspase分子起到直接结合及抑制的作用，抑制对由Fas及线粒体所介导的凋亡，具有内源性凋亡抑制作用[3-4]。在本组实验中发现，N组有Caspase和XIAP基础量表达，6h内SE后M组主要有阳性TUNEL、XIAP和Caspase-3细胞，TUNEL和Caspase-3表达高峰是在24 h左右（43.17±1.424），（35.26±1.428）；XIAP表达高峰在12 h（40.68±2.817）。ED组与M组相比，在12、24 h和48 h，TUNEL和Caspase-3阳性细胞数减少，XIAP阳性细胞数增加，（P<0.05）。依达拉奉通过提高XIAP蛋白的表达，抑制Caspase-3蛋白的表达，从而发挥保护神经元作用[5-6]。翟红等人[7]在研究中采用氯化锂-匹罗卡品大鼠癫痫持续状态模型，对50只大鼠在癫痫持续状态后脑内自由基活动情况进行观察，研究发现，在SE后，模型组脑组织匀浆中SOD活性下降，下降程度超过之前的25%，MDA含量增加，增加程度超过之前数据的50%。并且参与研究的两组大鼠TUNEL和Caspase-3表达高峰在24 h左右为（45±0.5）、（35±1.5）；并且XIAP表达高峰在12 h左右的数据为（40±1.5）；其选择的另一组TUNEL和Caspase-3阳性细胞数量也相对减少，为之前数据的85%左右，并且XIAP阳性细胞数开始增加，与本组研究结果较为相似。

依達拉奉（edravone，EP）作为全新的自由基清除剂，其能够通过对脂质过氧化作用进行抑制、抑制脑细胞所产生的过氧化作用，并且还能够让神经元死亡时间得到延迟，减轻不明原因诱发的人体组织或者脑水肿损伤现象[7-8]。研究表明EP可对多种炎症介质具有调节作用，同时HMGBl、TNF-α及IL-6中还具有抗炎介质作用，因此依达拉奉对SE后大脑的保护机制是多途径、多位点的，笔者将做进一步探讨。

[参考文献]

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[6] Su F，Wang Z，Cai Y，et a1.Beneficial effects of ethyl pyruvate in septic shock from peritonitis[J].Arch Surg，2017，142（2）：166-171.

[7] 翟红，翟军，李光建，等.依达拉奉注射液辅助治疗癫痫持续状态的临床效果观察[J].中国医药导报，2013，10（18）：91-92，95.

[8] 张志英. 癫痫损伤机制的探讨及依达拉奉对海人酸致痫大鼠海马神经元的保护作用[D].石家庄：河北医科大学，2015.

（收稿日期：2018-10-28）