胶原水凝胶在软骨与骨组织工程中的研究进展

刘永龙 黄江鸿 熊建义 王大平,

胶原水凝胶是一类具有亲水基团，不溶解于水却遇水溶胀并且保持其稳定的三维网格结构的聚合物材料[1]。胶原水凝胶通过共价键、范德华力或氢键等相互作用而交联形成三维网状结构，吸收水后能够显著溶胀，保留大量的水分并且能够保持其原有的三维结构而不被溶解，同时在一定条件下又可以脱水退溶胀。因为其含水量高，溶胀快，结构稳定与组织具有良好的相容性，胶原水凝胶作为仿生支架在软骨与骨组织工程学方面具有广阔的研究和发展前景[2]。近几十年来，随着国内外科研工作者对胶原水凝胶的结构、性能和应用的研究的逐渐深入，胶原水凝胶在医学方面的应用前景逐渐引起巨大的关注。

1 胶原水凝胶的性能

胶原作为细胞外基质的主要成分，在维持细胞外基质生物学性能和结构完整性方面起重要的作用。胶原本身具有特殊的四级结构，在特定情况下可以自发聚集形成胶原纤维[3]，并进一步形成水凝胶。胶原的这种自组装行为不但受到所处环境中的理化因素影响，而且通过引入外源性的添加物，也可以使水凝胶的最终结构、理化性质和生物化性能发生显著改变。

但是因单纯的胶原水凝胶机械强度不足、耐热性欠佳，有研究表明通过适当降低复合水凝胶中的胶原含量或者对胶原进行改性后制备获得的复合胶原水凝胶更有利于细胞生长并具备更加良好的生物力学性能。已有进一步的研究发现，将胶原蛋白与其他高分子材料交联后可以显著提高水凝胶的拉伸强度及抗降解能力[4]，达到软骨组织工程应用的要求。随着研究的深入，外源性引入物的报道层出不穷，除了经典的壳聚糖和聚乙烯醇外，海藻酸盐、羟基磷灰石、聚乙二醇和透明质酸等材料作为外源性添加物也取得良好的效果。这些外源性添加物虽然不具有胶原的自组装性能，但是通过与胶原的相互交联而形成的胶原水凝胶，具备了单纯胶原水凝胶所不具备的更加优越的生物力学性能、结构稳定性。

2 复合胶原水凝胶的种类

2.1 胶原-聚乙烯醇复合水凝胶

单纯的聚乙烯醇水凝胶因聚乙烯醇本身的亲水性和生物惰性，不利于其植入体内的血管的生成。聚乙烯醇进行与胶原等材料交联制备的复合水凝胶的结构和性能更加接近关节软骨。有文献报道[4]将聚乙烯醇与明胶溶液反复冷冻-融化获得一种大孔径的不可降解的复合水凝胶生物支架，这种复合水凝胶在兔软骨缺损模型中保持了良好的固定状态，并不会引起炎症反应，也不会对周围的软骨产生损害。倪茂君等[5]研究者用辐射交联与冻融循环相结合的方法，制备出配比最佳的聚乙烯醇/聚乙烯基吡咯烷酮/胶原复合水凝胶，研究发现胶原的含量与复合水凝胶的含水量成正相关，与复合水凝胶的力学强度成负相关。

2.2 壳聚糖胶原复合水凝胶

壳聚糖是多糖中仅有的一种碱性氨基多糖，其来源广泛，某些理化性质与细胞外基质中的主要成分氨基多糖极其相似，具有良好的天然抗菌性、生物降解性和组织相容性[6]。壳聚糖通过化学修饰改性后可以获得特殊理化性质，使用改性后的壳聚糖制备的复合水凝胶具有更好的生物相容性和生物力学性能。Liu 等[7]研究者用转谷氨酰胺酶对壳聚糖进行改性后，改性后的壳聚糖的氨基与被氧化的金刚乙醛的醛基交联反应。结果表明这种水凝胶具有清晰稳定的三维结构，具有较好的生物相容性和凝血功能。在软骨组织工程方面，以壳聚糖为组分的复合水凝胶也引起了关注。针对软组织工程需求的较高机械强度的水凝胶，有文献报道[8]发现壳聚糖可以有效提高复合水凝胶的生物力学性能，氧化锆、壳聚糖和明胶交联而成的高密度复合水凝胶在恒河猴腰椎缺陷模型实验中表现中较高的抗压能力，并有类似自体骨的修复效果。Ghorbani 等[9]使用改性后的壳聚糖与明胶、Ⅱ型胶原蛋白和蚕丝蛋白交联制备的复合水凝胶表现出优良的可注射型，这种复合水凝胶在4℃时表现为透明溶液，在37℃环境下30 min后为凝胶态，并具有良好的组织相容性和细胞吸附性。

2.3 透明质酸胶原复合水凝胶

透明质酸是软骨细胞外基质的一种成分，在众多的生物材料中具有优良的生物相容性，更高的结构孔隙率，更大的比表面积，并且具有促进细胞与生物之间结合，调控细胞分化、分裂等生物行为的作用，是一种理想的软骨组织工程材料。但是单纯的透明质酸-胶原复合水凝胶存在生物力学性能较差、机械强度不够，并且透明质酸作为一种生物多糖容易从支架材料中溶出，使其应用受到限制。Moulisova 等[10]的研究发现，同一种配比制备的透明质酸胶原复合水凝胶，采用化学和光化学交联方法制备的复合水凝胶与生物酶交联方法制得的复合水凝胶在生物体内更容易引发炎症反应。有研究者进一步研究[11]发现，在透明质酸胶原复合水凝胶中适量引入葡萄糖胺可以降低胶原的含量，进而降低复合水凝胶的交联密度，其生物力学性能更加适用于软骨组织缺损的修复。值得一提的是，透明质酸作为软骨细胞基质的一部分，透明质酸细胞外基质复合水凝胶与透明质酸胶原复合水凝胶相比，更能促进人脂肪源干细胞向成纤维细胞的转化。

2.4 海藻酸钠胶原复合水凝胶

海藻酸钠是一种来自褐藻的天然多糖，最早由英国化学家Stanford 首先对其研究，发现它具有浓缩溶液、形成凝胶和成膜的能力，进一步的研究发现其具有优良的生物力学性能、生物相容性和低免疫原性，但是因海藻酸钠过强的亲水性使细胞很难与其产生足够的黏附性进而影响细胞的生物学行为[12]。胶原对细胞具有良好吸附性而机械性能较差，与海藻酸钠交联后可以得到优劣互补的复合胶原水凝胶。有文献报道对海藻酸钠用氧化剂进行氧化修饰后得到醛酸钠，醛酸钠进一步与甲基丙烯酸甲酯反应后得到的产物与改性后的明胶水溶液混合发生Schiff 反应，然后在365 nm 紫外线照射下交联形成复合水凝胶。此种复合水凝胶的特点是具有双交联二级网络结构，与单一交联网络结构的水凝胶相比，具有更好的力学性能、生物相容性和可控生物降解率。宋益哲等[13]研究者将胶原溶液与海藻酸钠溶液进行共混处理制备得到胶原-海藻酸钙互穿网络水凝胶，该水凝胶孔隙分布均匀，多为贯穿孔，疏水性得到显著增强使得细胞黏附性增强，更有利于细胞的迁移。

2.5 其他材料与胶原交联制备的复合水凝胶

除了聚乙烯醇、壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠被广泛用于胶原复合水凝胶，聚乙二醇[14]、纤维素[15]等与胶原交联制备的复合水凝胶在创伤血管、神经修复领域均有涉猎。复合胶原水凝胶往往是用于损伤部位，有研究者在复合水凝胶中加入适当的干细胞[16]或者细胞生长因子[17]取得良好的促进组织修复的结果。以Fe3O4为代表的的磁性纳米复合水凝胶结合了纳米材料更加优良的容水性能和组织相容性与磁性材料的磁场响应性[18]，磁性纳米颗粒在一定时间里可被骨髓间充质干细胞吞噬，从而避免了在体内组织残留的问题，这种水凝胶可应用于药物的运输、释放[19]，骨与软骨组织工程填充材料[20]等医学领域。

3 胶原水凝胶的制备及其应用

3.1 胶原水凝胶的交联方法

胶原水凝胶本质是一种高分子聚合物，根据其键合方式的不同，交联方法可分为物理交联和化学交联两种方法。

3.1.1 物理交联

物理交联是在紫外光照射[21]、射线辐照[22]、加热、冷冻干燥[5,8]等物理处理条件下，氢键、离子键、结晶区域或疏水作用等非共价键作用使高分子产生相互交联的一种方式。通过物理交联制备的胶原水凝胶形态不具备永久性，常温下为凝胶态，通过加热可以转化为溶液，故又称之为“假凝胶”。物理交联方法的优点是交联过程中凝胶的各组分不产生化学反应，避免了可能有毒性作用的新物质产生，但是其不足也很明显，生物力学强度和热稳定性不足，制备出的胶原水凝胶的结构均匀程度也有欠缺[6]。目前报道的适用物理交联方法的主要有壳聚糖、葡萄糖、聚乙烯醇、海藻酸等。

3.1.2 化学交联

化学交联是通过选用合适的交联试剂对胶原中的羧基、氨基等官能团进行修饰与反应，高分子链相互交联后形成需要的胶原水凝胶。在化学交联中交联剂的选择起到关键性的作用，交联剂多为带醛基的化学试剂，如：戊二醛、聚乙烯醇等。化学交联方法的优点是制备出的胶原水凝胶的生物力学性能和热稳定性较好，缺点是生物降解性和生物相容性较差[19]，尤其是小分子的二醛可能具有细胞毒性。目前报道的化学交联方法使用的交联剂包括：乙二醛、聚丙烯酸、聚乙二醇等。

3.2 胶原水凝胶在软骨与骨组织工程中的应用

3.2.1 胶原水凝胶在软骨组织工程中的应用

软骨组织缺损一直是骨科基础与临床研究领域面临的一大难题。在软骨组织工程的研究中，关于各类型的胶原基复合水凝胶的报道层出不穷。随着研究的深入，胶原水凝胶在软骨组织工程方面的应用不再只满足于单纯的填充修复，科研人员发现可以将软骨组织工程三要素：种子细胞、支架材料及细胞因子[23]中的种子细胞和细胞因子加入到复合胶原水凝胶这种仿生材料中，使这种仿生材料在填充软骨缺损的同时具有诱导软骨生成的作用[1,15]，从而得到一个三位一体的解决方案。Fensky 等[24]将人间充质干细胞加入到复合胶原水凝胶中，体外实验表明10 d 后复合胶原水凝胶中的人间充质干细胞表现出向软骨分化的倾向。可注射型胶原水凝胶有广泛的应用前景，受到生物材料学家的特别关注，因为它们可以以最小代价完成微创手术进行注射，如图1 所示胶原水凝胶在软骨组织工程应用过程，可注射性胶原水凝胶可以任意形成以匹配不规则的缺陷形状达到修复软骨组织损伤的目标[25]。

3.2.2 胶原水凝胶在骨组织工程中的应用

临床中骨缺损发生的病理机制具有高度复杂性，尤其是大面积的骨组织缺损，骨组织填充材料的研究对骨组织工程的发展起着非常重要的作用[26]。有学者[27]认为骨缺损填充材料本身的力学结构性能和其与骨组织的连接紧密程度是骨缺损修复成功与否的关键。种类众多的骨缺损填充材料中骨水泥、钛合金、钽合金、磷酸三钙[28]等填充材料的研究较为广泛。有研究[29]发现高强度的胶原水凝胶因为更好的组织相容性和多孔隙结构是一种良好的骨缺损填充材料。Xavier 等[30]制备的纳米复合胶原水凝胶中含有纳米级别的硅酸盐颗粒，强度显著提升并且与周围骨组织的紧密程度增加，在没有加入任何诱导因子的情况下仍然能够促进骨组织的生成。Yuan 等[31]研究者使用纳米壳聚糖制备的复合胶原水凝胶也取得类似的结果。

图1 可注射型胶原水凝胶修复软骨组织损伤

4 讨论

经过科研人员的不断探索，胶原水凝胶应用于软骨与骨组织工程的研究不断深入，然而软骨与骨组织工程对生物材料在生物学力学性能、组织相容性和降解性等有很高要求，胶原水凝胶在软骨与骨组织工程领域的研究仍有进一步探索的空间。

以具有优良组织相容性的胶原为基础，进而探寻其他合适的一种或者多种与胶原形成优势互补的生物材料按照一定工艺流程与胶原共同制备出适用于软骨与骨组织工程的生物支架材料，这既是胶原水凝胶设计的核心思路，也是设计的难点[32]。软骨与骨组织工程对生物支架材料的生物力学性能有很高的要求，在设计胶原水凝胶时必须保证其具有一定的生物力学性能。提高胶原水凝胶的生物力学性能有两种途径：原材料的筛选和制备工艺的优化。胶原本身的机械强度不足，但是可以引入具有优良生物力学的生物材料组分。不论是传统的生物材料如壳聚糖、聚乙烯醇等，还是近期蓬勃发展的新型生物材料如纳米材料、磁性材料等，通过调节组分原材料的比例以获得满意的生物力学性能是一种较有效的解决思路。另一方面，制备的工艺也对胶原水凝胶内部微观结构的稳定性起到决定性的作用。与物理交联相比，化学交联制备出的胶原水凝胶的生物力学稳定性一般更优[19]，但是制备工艺中影响胶原水凝胶生物力学性能的因素很多，作者在研究中发现即使是相同的组分、同一种交联方法，制备过程中的处理温度、时长等因素都会影响到胶原水凝胶最终的生物力学性能。胶原水凝胶的制备流程还需考虑原材料的特性，适当情况下，多种交联方式结合也是一种很好的选择。

胶原水凝胶做为一种植入性生物材料，应具有优良的组织相容性，同时具有可控的降解性。设计胶原水凝胶时选取的组分原材料本身应具有一定组织相容性，对于组织相容性较差的组分，可以适当降低其比例以达到预期的组织相容性。应特别注意制备过程中其他引入物对胶原水凝胶的组织相容性的影响，有影响的引入物包括交联剂、发泡剂和采用化学交联制备过程中生成的其他产物[4]。应用于软骨与骨组织工程的胶原水凝胶在体内的降解应与软骨与骨组织的再生修复同步衔接进行。胶原水凝胶的生物力学稳定性与可降解性有一定的冲突关系，而在降解过程中维持一定的生物力学稳定性也是一个研究的难点，调节二者之间的关系需要大量的重复实验进行探索。胶原水凝胶体外的降解实验具有简单易行、低成本的优点，可以初步评估胶原水凝胶的降解性能，准确的降解性能数据则需要进行动物实验进行采集，在时间、精力和经济方面的成本较高。

目前国内外尚无商品化的胶原水凝胶产品应用于软骨与骨组织工程，相关的研究大多停留在制备工艺和动物实验的探索阶段。对于胶原水凝胶的性能评估与测定，主要包括微观表征、含水率、溶胀性、拉伸与压缩性能、组织相容性、降解性和细胞增殖、分化的指标测定[33]，虽然最重要的指标还是其在软骨与骨损伤表面的修复效果[11]，但是某一项指标的短板出现都可能导致所制备的胶原水凝胶不能达到软骨与骨组织工程的要求。目前国内外学者的研究热点是将胶原水凝胶与相关干细胞结合，期望制备出能够诱导软骨与骨细胞分化，具有更加优良修复效果的胶原水凝胶；同时研究人员也正致力于将交叉学科和新型材料与胶原水凝胶联合，诸如3D 打印技术[34]、合金材料、陶瓷材料和磁性材料有望与胶原水凝胶结合，为胶原水凝胶在软骨与骨组织工程领域的研究注入新的探索方向。

5 总结与展望

胶原水凝胶因其具有良好的组织相容性和低免疫原性，具备作为软骨组织工程仿生支架的先天优势，虽然其本身具有机械强度不够、热稳定性较差的缺点，但是通过众多研究者的努力，多种其他生物材料与胶原形交联形成的复合水凝胶具备了不同生物材料间优势并且互补了材料间的短板。胶原与其他生物材料交联成的复合水凝胶，因其良好的生物相容性、低免疫原性，优良的生物理化性质，作为软骨组织工程三要素：种子细胞、支架材料及细胞因子[32]。并且随着相关交叉学科的发展，3D 打印技术、陶瓷材料与复合水凝胶的结合的优势也逐渐体现出来，比如通过3D 打印技术制备的聚乙二醇胶原复合水凝胶在血管移植方面的探索；纳米材料、磁性材料与胶原水凝胶交联制备的新型复合胶原水凝胶在药物运输[26-27]和软骨组织修复方面[28]的研究也在逐渐深入。