TLR2/4配体增强的非特异性肝脏炎症对BALB/c小鼠自身免疫性肝炎的影响*

池 刚，荣 凯，裴晋红，冯作化

(1长治医学院生物化学教研室，山西 长治 046000；2太原市公安局小店分局，山西 太原 030032；3华中科技大学，湖北 武汉 430074)

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是慢性的界面性肝炎，其特点是淋巴细胞浸润及自身抗体和肝纤维化的产生[1-2]。临床研究表明，细菌和病毒可以引起AIH，某些药物也可以引起AIH[3-4]。这些因素的共同特点是能够引起肝脏非特异性炎症(non-specific liver inflammation)。然而，这些非特异性炎症最终如何引起AIH的产生目前尚未完全清楚。前期研究发现，腺病毒促进模拟抗原CYP2D6诱导易感型小鼠C57BL/6产生了AIH[5]。本研究通过观察由四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导的强烈的非特异性肝脏炎症对耐受型小鼠BALB/c AIH的影响，分析其在BALB/c小鼠AIH的启动中的原因，对进一步了解AIH的形成和发展的致病机制具有重要意义。

材 料 和 方 法

1 实验动物和试剂

6～9周龄雌性BALB/c小鼠购于湖北省医学实验动物中心(合格证号为211002300024158)。小鼠随机分为对照组(21只)和实验组(40只)。pcDNA3.1质粒购自Invitrogen；实验室构建CYP2D6质粒(pCYP2D6)和可溶性Toll样受体(soluble Toll-like receptor,sTLR)2/4质粒(psTLR2/4)，保存于-20 ℃冰箱；人CYP2D6蛋白购自Abcam。

2 方法

2.1动物接种 将小鼠随机分为：对照(naive)组、CCl4组、pcDNA3.1空质粒对照(p3.1)组、pCYP2D6组、psTLR2/4组、CCl4/psTLR2/4组和CCl4/psTLR2/4/pCYP2D6组，每组6只小鼠。腹腔注射CCl4，每3 d 1次，至第12天停止注射，剂量为0.5 mL/kg；尾静脉注射质粒pCYP2D6和psTLR2/4，其中pCYP2D6质粒使用浓度为每只小鼠每次50 μg，psTLR2/4质粒使用浓度为100 μg或400 μg。尾静脉注射pCYP2D6质粒从造模前2 d开始，每5 d 注射1次，至第20天停止注射，而psTLR2/4质粒从造模前2 d开始注射，每3 d 注射1次，至第15天停止注射。在指定时间处理小鼠并进行相关实验。

2.2病理学检测 取小鼠肝组织，4%甲醛固定后，石蜡包埋切片，常规HE染色和天狼星红染色，显微镜下观察并记录结果。肝脏AIH炎症评分：肝小叶炎症的评分，无炎症(0分)，轻微的肝小叶炎症(1分;<10%的肝实质面积)，中度肝小叶炎症(2分;10%～50 %的肝实质面积)，严重的肝小叶炎症(3分;>50 %肝实质面积)；肝脏汇管区的评分，无炎症(0分),轻微的汇管区炎症(1分;<1/3的汇管区面积)，中度的汇管区炎症(2分;接近汇管区面积的1/2)，严重汇管区炎症(3分;>2/3的汇管区面积);总评分为肝小叶和汇管区炎症之和[6]。肝纤维化评分：无纤维化记为0分;轻微肝小叶纤维化记为1分；汇管区周围纤维化，纤维间隔形成记为2分；局部桥接纤维化记为3分；严重的桥接纤维化记为4分[7]。

2.3ELISA检测 取小鼠血清和正常肝组织蛋白，包被肝组织蛋白或人CYP2D6蛋白于96孔板中，4 ℃孵育过夜后，洗板、封闭、抗体孵育、底物显示并用H2SO4终止反应，酶标仪读取数据，用Excel分析整理结果。

3 统计学处理

实验数据采用SPSS 16.0软件进行统计学处理。实验数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，两独立样本间比较采用t检验，多组间均数采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。 以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 TLR2/4配体增强了BALB/c小鼠非特异性肝脏炎症

研究结果显示，用sTLR2/4封闭TLR2/4配体减弱了由CCl4引起的肝脏非特异性炎症，而且随着sTLR2/4浓度的增加，最终消除了由CCl4引起的肝脏非特异性炎症，见图1。这表明CCl4引起的BALB/c小鼠非特异性肝脏炎症可能由TLR2/4配体介导。

2 TLR2/4配体增强的非特异性肝脏炎症对BALB/c小鼠自身免疫应答的影响

ELISA检测结果显示，封闭TLR2/4配体后，体内抗CYP2D6抗体(anti-CYP2D6)和抗自身肝蛋白抗体(anti-HP)的滴度下降，增大sTLR2/4浓度后，无抗CYP2D6抗体和自身抗体产生，见图2。这表明由TLR2/4配体增强的非特异性肝脏炎症促进模拟抗原人CYP2D6使BALB/c小鼠产生自身免疫应答。

3 TLR2/4配体增强的肝脏非特异性炎症对BALB/c小鼠AIH的影响

HE染色结果显示，封闭了TLR2/4配体后，AIH减弱，而且增大sTLR2/4浓度后，无AIH产生，见图3。这表明在模拟抗原CYP2D6存在的情况下，TLR2/4配体增强的非特异性肝脏炎症促进了BALB/c小鼠AIH。

4 TLR2/4配体增强的肝脏非特异性炎症对BALB/c小鼠肝脏纤维化的影响

天狼星红染色结果显示，封闭了TLR2/4配体后肝纤维化减弱，而且增大sTLR2/4浓度后，肝纤维化消失，见图4。这表明在模拟抗原CYP2D6存在的情况下，TLR2/4配体增强的非特异性肝脏炎症可能使BALB/c小鼠肝纤维化恶化。

讨 论

AIH的形成与病毒感染和药物作用有密切关系[3, 8-9]。无论是病毒还是药物，这些因素的共同特点均是引起了非特异性肝脏炎症，造成了肝脏损伤，从而释放危险信号，包括TLR2/4配体[10-12]。研究表明，非特异性的肝损伤释放的TLR2/4配体与AIH可能存在密切联系[12]。

Figure 1.TLR2/4 ligand enhanced liver non-specific inflammation in the BALB/c mice. A: the liver tissues with HE staining on day 10 (×200); B: inflammatory score of HE staining. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCCl4group.

图1 TLR2/4配体增强了BALB/c小鼠的肝脏非特异性炎症

Figure 2.TLR2/4 ligand enhanced liver autoimmune responses in the BALB/c mice. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCCl4/pCYP2D6 group.

图2 TLR2/4配体增强了BALB/c小鼠肝脏自身免疫应答反应

我们的研究结果显示，在封闭了体内TLR2/4配体后，非特异性肝脏炎症和AIH均下降，并且随着可溶性受体sTLR2/4浓度增加，非特异性肝脏炎症和AIH均消失，重要的是，在前期封闭体内TLR2/4配体后，后期纤维化也降低或消失。所以推测TLR2/4配体可能参与了AIH在耐受型小鼠BALB/c的启动。

尽管前期研究表明在C57BL/6易感型小鼠中由腺病毒和模拟抗原能引起AIH[5]，而且携带模拟抗原人CYP2D6的腺病毒载体的FVB小鼠也能观察到产生AIH的特征[13]。然而，携带模拟抗原的腺病毒载体在耐受型小鼠BALB/c中无法诱导产生AIH[4]，提示弱炎症可能无法启动耐受型小鼠的AIH。我们的研究结果表明，由CCl4引起的强烈的非特异性肝脏炎症可以诱导模拟抗原人CYP2D6打破耐受型小鼠BALB/c的免疫耐受，从而产生AIH和肝纤维化，并且我们发现，这种强烈的非特异性肝脏炎症是通过TLR2/4信号启动了BALB/c小鼠的AIH。

Figure 3.TLR2/4 ligand enhanced autoimmune hepatitis (AIH) in BALB/c mice. A: the liver tissues with HE staining in week 7 (×200); B: inflammatory score of HE staining. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCCl4/pCY2D6 group.

图3 TLR2/4配体增强了BALB/c小鼠AIH

Figure 4.TLR2/4 ligand enhanced liver fibrosis in the BALB/c mice. A: the liver tissues with Sirius red staining in week 9 (×200); B: fibrosis score of Sirius red staining. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCCl4/pCYP2D6 group.

图4 TLR2/4配体增强了BALB/c小鼠肝纤维化

综上所述，非特异性肝脏炎症可能参与了AIH的启动和发展，然而，弱的非特异性肝脏炎症可能无法启动耐受型小鼠BALB/c的AIH，只有强烈的非特异性肝脏炎症才能启动耐受型小鼠BALB/c的AIH，而且这种强烈的非特异性肝脏炎症可能是由TLR2/4配体介导的。因此，本研究结果对深入研究AIH的致病机制具有重要意义，为设计相应的药物靶点提供了有效路径。