长链非编码RNALINC00393在子宫内膜癌临床预后判断中的意义

麦碧 陈永秀 胡桂英 罗喜平 刘婷艳

子宫内膜癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈上升趋势［1］。据估计，2015年我国子宫内膜癌新发病例约为6.3 万，且发病呈现年轻化［2］。尽管经过早期诊断和及时治疗，大多数子宫内膜癌患者可以获得良好的预后结局；但仍有部分在确诊时已处于临床晚期，导致手术和放化疗效果差，病死率高［3-4］。因此，深入研究子宫内膜癌发病及转移的分子机制，并依此寻找新的诊断或预后分子标志物，将有助于进一步改善子宫内膜癌的诊治现状。

近年来，越来越多的证据表明，长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）的表达异常参与了人类复杂疾病，尤其是恶性肿瘤的调控过程［5-7］。LncRNA是一类长度超过200 nt 的转录本，广泛分布于哺乳动物和植物等物种中［8］，通过与其它分子相互作用，在基因转录、转录后及翻译水平起着重要的调节作用，从而影响细胞增殖、分化、凋亡和新生血管形成等过程，参与肿瘤发生发展的调控［9-10］。

癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）数据提示，与正常组织相比，位于13 号染色体的LncRNA（LINC00393）在子宫内膜癌患者的组织样本中的表达明显升高［11］。然而，LINC00393与子宫内膜癌的发生发展是否存在相关性尚未见报道。本研究拟通过检测患者子宫内膜癌组织中LINC00393的表达情况，并分析其与子宫内膜癌临床病理及预后特征的关系，进而探讨LINC00393在子宫内膜癌临床诊断及预后判断中的应用价值，以期为临床诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象资料

采集2012年1月至2017年12月间在本院妇科行手术治疗并经病理学确诊的150 例子宫内膜癌患者的肿瘤及肿瘤旁正常组织标本，并检测组织中LINC00393的表达情况。纳入患者年龄为25～82 岁，平均（52.4±16.3）岁。根据2018 新版国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期标准2018［12］，其中Ⅰ期和Ⅱ期患者共118 例，Ⅲ期和Ⅳ期患者32 例；子宫内膜样腺癌126 例，非子宫内膜样腺癌24 例；G1 级44 例，G2 级79 例，G3 级27 例；淋巴结阳性患者28 例，阴性患者122 例。所有患者术前均未接受放疗、化疗及激素治疗。本研究已获得医院伦理委员会批准，且获所有纳入患者知情同意。

1.2 随访方法

自病例确诊并收集后起，每半年随访一次。随访采用电话直接联系患者本人或其家属的方式，了解并记录患者的生存状况和疾病进展情况。随访截止日期为2018年12月31日。生存时间为自患者确诊之日至随访截止日期或死亡的时间。随访期间失访的病例不纳入后续生存分析。

1.3 主要试剂和仪器

RNA 的提取采用Trizol 试剂（货号：15596026）购自美国Thermo Fisher 公司。RNA 逆转录为DNA 的逆转录试剂盒（货号：RR047A）购自日本Takara 公司。检测LINC00393基因的表达量的SYBR Green 实时荧光定量PCR 预混液（货号：04707516001）购自瑞士Roche 公司。荧光实时定量PCR 仪（货号：EN61326）购自美国Applied Biosystems 公司。

1.4 肿瘤组织和肿瘤旁正常组织LINC00393 相对表达量的检测

采用Trizol 法常规提取组织中的RNA，并测量RNA 的浓度和纯度。取1 000 ng RNA 逆转录为cDNA。所有操作均按照试剂说明书进行。根据LINC00393全长基因序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计特异性引物序列如下：①LINC00393基因上游引物为TCTGCTTCCTGTTTGGAGGT，下游引物为CATGTGAGACGCCAACAACT；②内参β-actin管家基因上游引物为GGCGGCACCACCATGTACCCT，下游引物为AGGGGCCGGACTC GTCATACT。实时荧光定量PCR 的反应体系共25 μL，其中上下游引物各0.5 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 10 μL，SYBR Green 预混液12 μL。反应条件：95℃预变性5 min；扩增40 个循环，每个循环包括95℃变性30 s，60℃延伸30 s，72℃退火1 min；72℃复性5 min。LINC00393的相对表达量=2^-［（肿瘤组织目的基因Ct 值-肿瘤组织内参基因Ct 值）-（肿瘤旁正常组织目的基因Ct 值-肿瘤旁正常组织内参基因Ct 值）］。

1.5 LINC00393 表达量与子宫内膜癌患者临床病理及预后特征的关系

比较子宫内膜癌患者肿瘤与肿瘤旁正常组织中LINC00393的表达水平。根据LINC00393表达情况，将患者分为高表达组与低表达组，其中高表达组患者肿瘤组织中LINC00393相对表达量高于其肿瘤旁正常组织，反之则为低表达组。分析高表达组与低表达组患者的年龄、肿瘤病理类型、FIGO 分期、肿瘤分级、淋巴结转移情况及生存时间的关系。

1.6 LINC00393 基因潜在的调控机制分析

下载TCGA 数据库中所有子宫内膜癌患者的转录组表达数据，利用R 软件的WGCNA 软件包构建LINC00393基因可能调控的共表达网络。

1.7 统计学方法

本研究所有数据的处理和分析均应用3.2 版R软件。计量资料以x±s表示，计数资料以率或百分比表示。肿瘤与肿瘤旁正常组织中LINC00393表达量的比较采用配对t检验；LINC00393表达量与临床病理特征的关系分析比较采用单因素Logistic回归分析，并计算比值比（odds ratio，OR）和95%置信区间（confidence interval，CI）。患者生存分析采用Kaplan-Meier 法，并采用Log-rank 检验比较组间生存时间的差异。采用多因素Cox 风险比例回归模型分析LINC00393基因高表达是否为独立于患者年龄、肿瘤病理类型、FIGO 分期、肿瘤分级、和淋巴结转移情况外，影响预后结局的独立危险因素。所有检验均为双侧检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC00393 基因的表达情况

子宫内膜癌患者总体上肿瘤组织中LINC00393基因的相对表达水平明显高于肿瘤旁正常组织（0.003 1±0.001 3vs0.001 6±0.001 0，P＜0.001）。在150 例子宫内膜癌患者中，78%（117/150）肿瘤组织中LINC00393基因表达水平高于肿瘤旁正常组织（高表达组），其余22%（33/150）患者肿瘤组织表达水平低于肿瘤旁正常组织（低表达组）。高表达组与低表达组患者LINC00393基因表达的分布情况见图1。

图1 LINC00393在子宫内膜癌的表达Figure 1 Expression ofLINC00393 in endometrial cancer

2.2 LINC00393 高表达与子宫内膜癌临床特征的关系

分析结果显示，高表达组患者的淋巴结转移率明显增加，而2 组患者的年龄、肿瘤病理类型、FIGO 分期和肿瘤分级无明显差异。具体结果见表1。

2.3 2 组患者子宫内膜癌预后的比较

对于随访数据，高表达组删失27 例，低表达组删失18 例。其中，高表达组获随访（11.5～83.3）月，中位随访时间为59.2月；低表达组获随访（13.6～79.2）月，中位随访时间为52.4月。生存分析结果显示，高表达组患者的中位生存期为23.3 个月，较低表达组患者的中位生存期（30.2 个月）明显缩短。2 组患者的生存曲线见图2。多因素Cox 风险比例回归模型分析结果显示，肿瘤分期晚和肿瘤LINC00393表达高是本研究纳入患者的独立危险因素。具体见表2。

表1 2组患者子宫内膜癌临床病理特征关系的单因素Logistic 回归分析Table 1 Univariate Logistic regression analysis of clinical and pathological characteristics of endometrial cancer in the 2 groups

图2 LINC00393 不同表达情况下子宫内膜癌患者的生存曲线Figure 2 Survival curvel of endometrial cancer patients with different expression levels ofLINC00393

2.4 LINC00393 功能机制的生物信息学分析

生物信息学分析TCGA 数据显示，LINC00393基因存在复杂的共表达基因关系网络。具体见图3。

3 讨论

近年来，子宫内膜癌相关研究取得了较大进展，并对临床实践产生了非常重要的影响；然而，其发病率仍居高不下。在大多数病例中，子宫内膜癌通常是在上皮内有非恶性的内膜性新生物逐渐发展而来的［13］。如果能够早期发现、早期治疗，降低转移风险，子宫内膜癌的总体预后相对较好。因此，精准寻找子宫内膜癌转移和预后相关的标志物意义重大。本研究从LncRNA入手，发现LINC00393与子宫内膜癌淋巴结转移和预后差存在明显关系，并可以作为子宫内膜癌预后判断的独立危险因素。

考虑到基因基础表达量的差异，为了更为直接地分析LINC00393与子宫内膜癌发生发展的关系，本研究根据肿瘤组织与肿瘤旁正常组织表达差异的不同，将患者分为高表达组和低表达组。这样做的优点是可以自身作对照，分析LINC00393基因表达高低对肿瘤的影响，从而更为直观的观察该基因在肿瘤发生发展中的作用。本研究发现，子宫内膜肿瘤组织中LINC00393基因的表达量总体升高。虽然并未发现其表达增加与患者年龄、肿瘤类型、FIGO 分期以及肿瘤分级存在明显关系，但值得注意的是，本研究发现该基因的表达与淋巴结阳性密切相关。LINC00393高表达的肿瘤患者，淋巴结的阳性率高达22.2%，而低表达组仅有6.1%。众所周知，淋巴结转移是预后的不良因素［14］。本研究通过生存分析，进一步发现LINC00393高表达患者的生存时间明显缩短，Cox回归分析再次提示LINC00393高表达是预后不良的独立危险因素。

表2 子宫内膜癌患者预后影响因素的Cox 风险比例回归模型分析Table 2 Multivariate Cox regression analysis of influence factors for survival of patients with endometrial cancer

图3 TCGA 数据中LINC00393 共表达基因的关系网络Figure 3 Networks of co-expression genes related toLINC00393 in TCGA database

越来越多的研究证据显示，非编码基因作为基因调控网络中的重要成员，为研究复杂疾病的病理生理过程、揭示其致病机理提供了新的重要视角［15-16］。由于LncRNAs 参与了肿瘤的发生发展过程，因此，有望成为肿瘤诊断和治疗的新靶标［17-19］。不例外的是，LncRNA在子宫内膜癌的发生发展中亦起着非常重要的作用。本研究通过生物信息学分析发现，基质金属蛋白酶1（matrix metalloproteinase-1，MMP1）和锌指蛋白2（zinc finger protein-2，ZIN2）等基因与LINC00393的表达量协同升高，且在共表达的诸多基因中与LINC00393最为关系。其中，MMP 家族是一组可以水解细胞外基质的蛋白酶，因此广泛参与细胞的侵袭、转移过程［20］。本研究的这一发现同样得到其他研究支持。Wang 等［21］研究发现，LncRNA BANCR在I 型子宫内膜癌组织呈高表达状态，BANCR表达与FIGO 分期、病理分级、肌层浸润和淋巴结转移明显有关；进一步研究发现，BANCR通过激活ERK/MAPK 信号传导途径调节MMP1的表达，从而促进子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭。段玉真等［22］也发现，MMP9在子宫内膜癌患者肿瘤组织中呈现高表达状态，并与肿瘤转移关系密切。而对于ZIN2，Bidus 等［23］发现，其在淋巴结阳性的子宫内膜癌患者中呈现过量表达状态。这样不仅与本研究发现一致，而且也很好地解释了LINC00393与淋巴结转移密切相关的原因。

理论上，非编码蛋白的基因数目多于编码基因。然而，虽然近来LncRNA在与子宫内膜癌相关研究领域的关注度逐渐增加，并取得了一定的进展，但研究深度仍远不如编码基因深入。本研究作为延伸和补充，发现了LncRNA家族中另一成员LINC00393同样与子宫内膜癌密切相关。虽然笔者没有对LINC00393参与子宫内膜癌发生发展的具体机制进行深入研究，但笔者通过对LINC00393共表达基因的分析，发现存在一个与其表达密切相关的复制基因网络。针对网络中的基因，本研究初步的基因本体分析结果显示，这些基因广泛参与细胞增殖、粘附、侵袭与转移过程。未来，笔者将继续深入研究LINC00393基因与共表达网络中其他基因的相互作用情况，从而揭示其参与子宫内膜癌肿瘤发生发展的具体分子机制。

综上所述，LINC00393在子宫内膜癌患者肿瘤组织中呈现高表达状态，且与患者淋巴结转移存在明显关系。LINC00393高表达患者的生存时间缩短，可作为不良预后的独立预测因素，有望转化为用于子宫内膜癌患者临床预后判断的新的分子标志物。