两种核酸提取方法检测丙肝HCV-RNA定量的比较

陈斌鸿，罗俊轩，张华

(佛山市第一人民医院，广东 佛山 528000)

丙型肝炎病毒(hepatitis C viral，HCV)是一种全球性传染的病原体，人体感染后会引起丙型病毒性肝炎，主要通过性传播、母婴垂直传播、血液传播等途径引起传染。丙肝病毒是单股正链RNA病毒[1-2]，不稳定，极易变异，医学界目前尚未研制出有效预防丙肝的疫苗。因此，早期对丙型肝炎病毒进行准确的定量及对丙肝科学的诊断是十分关键的。目前，血液中HCV-RNA的实时荧光定量PCR[3-4]已成为HCV诊断，丙型肝炎患者抗病毒药物治疗疗效检测及血液筛查的重要手段，为满足实验室要求，现需对两种核酸提取[5-6]方法定量检测HCV-RNA的正确度及与原有达安手工法结果的一致性进行比较，选出符合临床实验室要求的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2018年11月至2019年1月在佛山市第一人民医院用Roche全自动核酸分析仪检测患者阳性血清样本30例， -80 ℃冰箱保存。

1.2 仪器与试剂

1.2.1仪器 两种磁珠法使用SMART32半自动核酸提取仪进行丙型肝炎病毒核酸提取。提取后的核酸均使用IMPLEN分光光度计进行纯度检测。使用ABI Prism7500实时荧光PCR进行扩增及分析。

1.2.2试剂 中元磁珠法所用试剂由重庆中元生物技术有限公司提供，达安磁珠法和达安手工法所用试剂由中山大学达安基因股份有限公司提供，所用试剂均在有限期内。

1.3 实验方法

1.3.1HCV-RNA提取 严格按照各自试剂说明书要求进行核酸提取。

1.3.2HCV-RNA核酸纯度检测 分别用各种方法试剂对应的洗脱液进行校准和零点，检测相应吸光度OD260与OD280的比值并记录数据。通过数据分析与观察，所有提取的核酸的纯度在1.8-2.2的可接受范围内，均可以进行下一次扩增分析。

1.3.3HCV-RNA核酸浓度检测 三种方法提取的HCV-RNA均在ABI Prism7500实时荧光PCR仪进行核酸浓度检测。

2 结果

2.1 两种方法正确度性能评价

选取实验室现用的通过室间质评的达安手工法作为比较方法，中元磁珠法和达安磁珠法为实验方法。参考EP9-A2[7]文件提供的方法进行正确度比对和偏倚评估。

2.1.1根据实验数据作图 根据ABI Prism7500实时荧光PCR仪分析得出的实验数据，通过对数转换，以比较方法达安手工法的检测结果为X，实验方法中元磁珠法和达安磁珠法分别为对应的Y，分别作出对应的散点图。分别以4倍的相对差值的均值作为可接受限作偏倚图。

2.1.2方法间离群值检验 以4倍的相对差值的均值作为可接受限，通过观察图3和图4，可见没有差值超出控制限，故方法间无离群值。

图1 中元磁珠法检测结果对达安手工法散点图

图2 达安磁珠法检测结果对达安手工法散点图

图3 中元磁珠法与达安手工法的偏倚图

图4 达安磁珠法与达安手工法的偏倚图

2.1.3合适范围的检验 参考文件EP9-A2，当r≥0.975(或R2≥0.95)时，即代表X取值范围合适。通过计算得出图1中的r=0.984大于0.975，即可认为中元磁珠法的取值范围合适；同理通过计算得出图2的r=0.988大于0.975，即可认为达安磁珠法的取值范围合适。

2.1.4线性回归分析 中元磁珠法与达安手工法的线性回归方程为：y=0.926x+0.150；达安磁珠法与达安手工法的线性回归方程为：y=1.011x+0.111。

2.1.5预期偏倚的计算和比较 当HCV-RNA在医学决定水平为1000 IU/mL，通过对数转换即Xc=3 IU/mL，以1/2允许总误差的标准计算允许偏倚，其允许偏倚为0.15 IU/mL。计算得出中元磁珠法的预期偏倚Bc=a+(b-1)*Xc=0.1508，预期偏倚的95%可信区间为[-0.388,0.245]。符合预期偏倚的下限<允许偏倚<预期偏倚的上限的判断标准，即认为中元磁珠法正确度性能可以接受。同理通过计算，达安磁珠法的预期偏倚Bc=a+(b-1)*Xc=0.147 4，预期偏倚的95%可信区间为[-0.135,0.430]。符合预期偏倚的下限<允许偏倚<预期偏倚的上限的判断标准，即认为达安磁珠法正确度性能可以接受。

2.2 一致性比对

使用Kappa检验进行一致性比较。严格按照Kappa检验的运算步骤，经计算结果如表1所示：

表1 相关系数与线性回归方程

3 讨论

丙型肝炎作为临床上一种常见的传染性疾病[8]且具有较多的传播途径，不单威胁着个人的身体健康，已经成为严重的社会和公共问题。丙型肝炎病毒是一种单股正链RNA，具有易变异的特征，因为HCV-RNA的免疫原性较弱，导致机体相应的免疫反应水平较低，所以容易形成反复感染进而加重病情。而且到目前为止尚未有丙肝疫苗可供使用，所以对于临床医生与患者来讲，如果能够更早、更准确的检验出病毒，对于患者后期的治疗会有非常大的帮助。在临床上，丙肝HCV-RNA准确的定量对于丙型肝炎的诊断[9]，丙型肝炎患者抗病毒药物治疗疗效检测及血液筛查都有着十分重要的作用[10]。而核酸提取是HCV-RNA准确定量的关键环节，核酸提取的差异可直接影响PCR扩增效果与定量检测结果。所以对于临床实验室而言选择一种符合要求的核酸提取方法，是对实验室人员，临床医生以及病人负责的做法，需要严谨的态度。

本实验选取实验室现用的通过室间质评即准确度得到确认的达安手工法作为比较方法，参加比较的中元磁珠法和达安磁珠法两种方法为实验方法。对选出的30例阳性患者标本进行检测，比较两种核酸提取方法检测丙肝HCV-RNA定量的差异。实验结果显示两种核酸提取方法检测丙肝HCV-RNA定量结果的正确度均可接受，中元磁珠法与达安手工法的一致性不及达安磁珠法与手工法的一致性好。笔者认为造成差异的原因可能是不同厂家引物设计可能存在差异。

本研究的中，由于价格高昂的原因，没有使用Roche全自动核酸分析仪这一行业“金标准”作为比较方法而是选择了价格较低的达安手工法作为比较方法。本实验由于操作步骤较多，核酸提取过程所需时间长，未能在两个小时内完成实验，但使用不同方法所提取核酸的纯度检测均在可接受范围之内，不能排除RNA轻微的降解和丢失。除此之外，从临床实验室引入新方法关注的耗时和耗费而言，实验室现使用的达安手工法操作繁琐，操作步骤较中元磁珠法和达安磁珠法更多，需要多次离心与更换离心管，在多次的震荡离心过程中，易造成RNA的丢失与降解。中元磁珠法虽前准备步骤多，但提取反应时间短，与达安磁珠法所需时常相当。在耗材价格方面，磁珠法比较贵，且没有独立收费标准。

综上所述，在两种磁珠法核酸提取方法检测丙肝HCV-RNA定量的比较中，进行比较的两种方法正确度均可接受，而达安磁珠法的检测结果具有较好的一致性。实验室可根据正确度，一致性，耗时与费用选择符合本实验室要求的方法。