酸敏感离子通道1在肿瘤中的研究进展

(南华大学 1.衡阳医学院肿瘤研究所，肿瘤细胞与分子病理学湖南省重点实验室,2.附属南华医院，湖南 衡阳 421001)

以慢性炎症、免疫抑制、缺氧以及代谢和生化改变为特征的肿瘤微环境(tumor microenvironmen，TME)是影响肿瘤细胞存活、生长和进化的环境[1]，酸度是肿瘤微环境的内在特征，在肿瘤组织中非常常见。在生理条件下，恶性肿瘤与正常组织相比，表现出酸性细胞外环境，而细胞外的酸性环境对肿瘤细胞有重要作用。低氧条件下，肿瘤脉管系统紊乱，异质血流和糖酵解增加(Warburg Effect)是实体瘤常见的特征，这常常导致酸中毒。肿瘤细胞可以将酸中毒作为信号以促进它们的侵袭和转移[2]。现已发现在肺癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤中均存在ASIC1的异常表现。

1 ASIC1的结构及分布

ASICs是一类可被胞外质子激活的非选择性阳离子通道，属于ENaC/DEG(上皮Na+通道/退化蛋白)通道家族成员[3]，可被细胞外质子激活[4]，对Na+有着通透性。到目前为止，共发现了6个由4个基因编码的ASIC亚基蛋白，包括ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4[3]。

ASIC1由500多个氨基酸组成，各亚基的氨基酸序列在物种间高度保守，对鸡的ASIC1和单分子成像的结晶揭示了ASIC组装为三聚体[3]，它们包含TM1和TM2两个疏水跨膜结构域和1个主要由半胱氨酸组成的胞外环，其N端和C端在胞内。ASIC1a由ACCN2基因编码，在中枢神经系统和周围神经系统均有广泛表达，而ASIC1b主要由ACCN1编码。ASIC1a主要分布于中枢的大脑皮质、海马、小脑、松果体、杏仁核、上丘脑、脊髓等部位[5]，在味蕾细胞、外周软骨细胞、人类造骨细胞中也有表达，在软骨细胞中最为丰富。肠神经节细胞中也有ASIC1a的表达，ASIC1b只发现存在于外周背根神经节中。

2 ASIC1的生物学功能和特性

ASIC1对Ca2+有特异性通透性[6]，还参与各种病理和生理过程，如脑缺血，癫痫发作，突触可塑性，学习、记忆，伤害感受和疼痛等，肿瘤细胞甚至可以以酸中毒作为信号来促进它们的侵袭和转移[2]。

ASIC1半数最大活化所需的pH值在4.9到6.8之间[7]，所有ASICs亚基都能被阿米洛利抑制，狼蛛毒素(PcTx)也能通过促进ASIC1a的脱敏状态，特异性地抑制ASIC1a电流。

3 ASIC1在肿瘤中的作用机制

Ca2+是癌细胞迁移和侵袭的重要介质。从机制上讲，ASIC1是酸中毒通过钙内流介导的信号传导所必需的。酸中毒对正常细胞的生长和增殖具有破坏性，但肿瘤细胞已适应酸性微环境，微环境中的低pH值能促进肿瘤生长和转移[8]。ASIC1a通过参与酸中毒，介导肿瘤细胞的迁移和侵袭[9]。在静息状态下，[Ca2+]i保持在一个较低水平，当细胞处于酸性环境时，[Ca2+]i升高，pH越低，[Ca2+]i升高越明显。ASIC1在细胞中能触发Ca2+电流，升高[Ca2+]i，而抑制ASIC1的功能可减弱酸性环境对[Ca2+]i升高的刺激。ASIC1通过介导Ca2+内流调控酸性环境诱导的氧化应激反应和NF-κB激活，并诱导ROS的产生[6]。ASIC1能感受细胞外酸性环境这一信号，并将其通过升高[Ca2+]i和RhoA活性的方式传递给细胞，以刺激癌细胞的EMT，从而导致癌细胞侵袭转移能力增强[7](图1)。近年来，许多医学研究试图通过研究ASIC1在不同肿瘤中的表达水平及具体机制，从而明确肿瘤细胞凋亡的过程，最终达到治疗肿瘤的目的。

图1 ASIC1在肿瘤中的作用机制

4 ASIC1与肿瘤

4.1 ASIC1与肺癌

Wu等[10]发现ASIC1能在人肺癌A549细胞中功能性表达，用MTT法测定细胞存活率时发现，细胞在pH 7.0的环境下存活率没有受到影响，而在pH 6.5和pH 6.0时细胞存活率显著增加，表明酸性细胞外介质以pH依赖性的方式促进A549细胞增殖。使用划痕实验，结果同样表明酸性胞外介质也以pH依赖性的方式显著刺激A549细胞迁移，确定了ASIC1在A549细胞增殖和迁移中的作用。过表达的ASIC1a不影响A549细胞在中性环境下的增殖和迁移，但它在pH 6.0的环境下显著促进A549细胞增殖和迁移[10]，在中性环境中，使用特异性ASIC1a抑制剂PcTX1和利用siRNA敲除ASIC1a，对A549细胞的增殖和迁移没有影响。相反，酸性环境下使用PcTX1和敲除ASIC1a 却能显著抑制A549细胞的增殖和迁移，表明ASICs介导细胞外酸中毒诱导的A549细胞增殖和迁移。为进一步确定酸中毒的分子机制，Wu等[10]研究了细胞外酸中毒对A549细胞中[Ca2+]i的影响，发现低细胞外pH能显著增加A549细胞中的[Ca2+]i，但特异性ASIC1a抑制剂PcTX1阻断了这种作用，表明ASICs介导细胞外酸中毒所诱导的[Ca2+]i的增加，这些结果表明ASIC-钙信号能介导细胞外酸中毒引起的肺癌细胞的增殖和迁移，而ASIC1可作为肺癌的预后标志物和治疗靶点。

4.2 ASIC1与胰腺癌

在胰腺癌中表现出积极的上皮细胞-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程，说明了EMT在胰腺癌发生中起着关键作用[11]。Zhu等[7]通过逆转录PCR和定量实时RT-PCR法发现胰腺癌细胞系中ASIC1和ASIC3的mRNA与正常胰腺导管细胞(HPDE)相比显著增加，同样，免疫印迹实验证实，与正常胰腺细胞相比，胰腺癌细胞中ASIC1和ASIC3的蛋白质增加，免疫荧光测定显示胰腺癌标本中的ASIC1和ASIC3与癌旁组织相比也明显增加。而同时或分别敲除ASIC1和ASIC3，应用ASICs抑制剂阿米洛利或PxTC1后，PANC-1和BxPC-3细胞中的标记物如波形蛋白，N-钙粘蛋白，Snail和ZEB1的表达降低，而E-钙粘蛋白升高，这些结果表明ASIC1和ASIC3参与了酸性诱导的胰腺癌细胞的EMT，并对其有促进作用。为明确ASIC1是否通过调节[Ca2+]i影响酸度诱导的EMT，Zhu等[7]通过对比不同pH下胰腺癌细胞内的[Ca2+]i后发现，与正常pH相比，酸性环境下PANC-1和BxPC-3细胞的[Ca2+]i以pH依赖性的方式升高，同时，敲低ASIC1或ASIC3能显著减弱[Ca2+]i升高，并且也能被阿米洛利预处理所阻断。这些结果表明，激活ASIC1和ASIC3能使酸性微环境唤起[Ca2+]i的升高。RhoA属于G蛋白家族，且能被[Ca2+]i激活。pH升高时，PANC-1和BxPC-3细胞中RhoA的活性明显升高，相反敲低ASIC1或使用阿米洛利对ASIC1进行抑制，酸性环境下的RhoA活性显著降低。此外，用BAPTA-AM这一钙螯合剂能降低酸诱导的RhoA活性，敲低RhoA也能显著抑制酸性诱导的EMT并削弱胰腺癌细胞的侵袭和迁移，故通过ASIC1调节的酸诱导EMT的[Ca2+]i信号传导途径可能有一部分归因于RhoA信号传导的激活。因此ASIC1可能成为胰腺癌治疗干预的目标，而针对[Ca2+]i或其下游效应器RhoA为目标可能为胰腺癌提供更可行的治疗策略。

4.3 ASIC1与胃癌

Zhang等[12]通过RNA测序检测胃癌患者正常胃组织和胃癌组织中差异表达的基因，并通过实时PCR进一步证实了ASIC1和自噬相关蛋白5(ATG5)在胃癌细胞SGC-7901中表达。在SGC-7901细胞中分别沉默ATG5和ASIC1，SGC-7901细胞的生长被显著抑制，表明ATG5或ASIC1的下调能抑制胃癌细胞的生长。敲低ASIC1后，SGC-7901细胞中的ATG5表达水平降低，而酸处理能够补救因ASIC1沉默导致的ATG5的下调。这表明ASIC1通过激活胃癌细胞中的ATG5来上调自噬。而在小鼠模型中，ASIC1下调延长了小鼠的存活时间并降低了肿瘤体积。这些数据表明对ASIC1的表达或活性的抑制可通过抑制自噬而成为一种新的胃癌靶向疗法，并且可能对广泛的多种癌症的治疗产生影响。

4.4 ASIC1与肝癌

Jin等[9]通过免疫组化法测定了15组肝癌组织和癌旁组织中ASIC1a蛋白的表达水平，发现癌组织中的蛋白水平明显高于癌旁组织，肝癌伴术后转移患者的转移率高于未转移的患者，且与晚期临床分期相关。在pH 6.5的环境下培养SMMC-7721细胞，测定ASIC1a的mRNA和蛋白含量，发现其显著高于在pH 7.4和pH 6.0环境下培养的细胞，提示中度酸性细胞外环境能促进ASIC1a的表达。沉默ASIC1a后，ASIC1a的mRNA和蛋白质表达显著下调，而进一步的划痕实验和Transwell侵袭迁移实验发现沉默ASIC1a能抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。提示ASIC1a参与肝癌细胞的侵袭与迁移，并发挥重要作用。

Jin[13]进一步探讨了肝癌与ASIC1a表达水平之间的临床相关性。在测定了90个肝癌组织中ASIC1a的mRNA和蛋白水平，发现其均上调，而敲除ASIC1a后肝癌细胞停滞于G1/S期，并启动细胞凋亡，抑制肝癌细胞增殖，作为Wnt/β-catenin/LEF-TCF靶基因Osx、Runx2、c-Myc和Cyclin的表达水平也降低，表明ASIC1a可能通过β-catenin/LEF-TCF轴抑制肝癌细胞增殖。Jin[26]还通过免疫荧光发现，ASIC1a敲除后不仅降低了总β-catenin的表达水平，显著抑制了肝癌细胞中β-catenin的核积累，还导致了β-catenin调节剂GSK3β被激活，β-catenin磷酸化。也就是说，在酸性微环境中，ASIC1a可以保护β-catenin免于磷酸化和泛素化，帮助β-catenin核积累，进而促进肝癌细胞增殖。因此，ASIC1a既能促进肝癌细胞侵袭与迁移，可能也是肝癌的潜在诊断和预后标志物，而充分了解ASIC1a在人类癌症中的确切作用可能为开发新的治疗方法提供机会。

Zhang等[14]进一步测定了肝癌中ASIC1a的表达水平，利用免疫印迹法在8组肝癌组织和癌旁组织中检测ASIC1a的表达，结果显示ASIC1a在肝癌组织中高度表达，与之前的研究一致，这些数据表明ASIC1a上调与HCC的肿瘤进展呈正相关。而通过蛋白质印迹法研究了ASICs在耐药性肝癌细胞Bel7402/FU和HepG2/ADM中的表达，发现ASIC1a表达显著上调，但ASIC2,3和4表达没有明显增加。在耐药性肝癌细胞中，ASIC1a仅在其存在于膜上的情况下发挥其作用，但pH 6.5时的ASIC1的表达高于pH 7.4时的表达，表明酸性细胞外pH不仅是ASIC1a的激活剂，而且还促进其向膜的运输。这些数据显示，ASIC1a上调可能与肝癌中的肿瘤耐药性也呈正相关。

4.5 ASIC1与胶质瘤

在整个神经系统中，ASIC1广泛表达，其在学习、记忆，伤害感受和疼痛等病理和生理过程中起重要作用。越来越多的证据表明，ASICs与恶性神经胶质瘤有关，它能表达ENaC/DEG家族的多个成员，并特征性地表现出阿米洛利敏感的阳离子电流[15]。在体外，胶质瘤细胞系的增殖会受到低pH值的影响[16]。Tian等[17]将胶质细胞瘤细胞系分为R54系和R8系，这两种细胞系都能功能性表达ASIC1a的ACCN2，但表达ASIC1b的ACCN3的能力较弱，无法检测。在分析数据后，发现胶质瘤细胞表达的ASIC1a对提高患者生存率具有实质性影响，而调整ASIC1a的pH敏感性，能使胶质瘤细胞具备感知周围酸性环境的能力，改善其预后。

4.6 ASIC1与乳腺癌

NF-κB是一种多效转录因子，可以被包括低细胞外pH在内的多种刺激而激活。Gupta等[18]通过免疫印迹、基因测定和免疫荧光染色确定酸中毒能诱导乳腺癌细胞中的NF-κB活化。在酸性条件下产生的ROS可以使PTEN-AKT信号的负调控因子失活，从而激活AKT和PDK1，导致NF-κB活化。Gupta等[6]还利用异种移植小鼠模型，发现ASIC1的抑制剂如阿米洛利和PcTx-1能够抑制肿瘤生长，减轻肿瘤重量，并可能作为癌症治疗的潜在靶标。ASIC1能调节Ca2+这一癌细胞迁移和侵袭的重要介质[19]，而Ca2+能显著抑制ROS的产生，提示ASIC1对于酸性条件下ROS的产生至关重要。敲除ASIC1可以消除酸中毒诱导的ROS产生，使用ASIC1抑制剂后也能抑制酸中毒诱导的ROS产生，重新表达后的ASIC1能恢复细胞中ROS的产生，而敲除ASIC1对H2O2诱导的ROS产生没有影响，故在酸中毒中ASIC1能特异性调节ROS的产生。ASIC1是酸中毒引起的ROS产生所必需的，其可能为酸性微环境下调节AKT活化的中心分子。了解ASIC1介导的ROS的产生以及相关信号通路的激活将为肿瘤细胞在酸性肿瘤微环境下的侵入和转移提供新见解，并可能作为乳腺癌预后标志物和治疗靶点。

4.7 ASIC1与透明细胞癌

Li等[20]通过实时定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹分析，分别测定了ASIC1在肾透明细胞癌(CCRCC)组织中的mRNA和蛋白质水平的表达，评估了75例CCRCC患者的肿瘤组织和相邻正常组织中ASIC1的表达后，发现正常肾脏和CCRCC样品中都能检测到ASIC1表达，但CCRCC组织中ASIC1和mRNA的表达明显低于正常肾组织，且其表达与肿瘤分期和患者年龄无相关性，但与更高的肿瘤分级相关。故ASIC1可能潜在地作为新的生物标志物，甚至是CCRCC治疗靶点。而进一步明确ASIC1在CCRCC发生、发展和转移中的作用机制，将会为ASIC1在CCRCC的诊断和治疗提供新的思路。

5 展 望

ASIC1作为细胞外质子的关键受体，参与涉及酸中毒在内的多种病理生理过程，最终参与肿瘤的侵袭和转移，其在肿瘤中的作用得到越来越多学者的关注。目前，关于ASIC1与肿瘤的研究仍处于起始阶段，其在肿瘤中的具体调控机制仍不十分清楚。因此，深入探讨ASIC1在不同肿瘤中的作用、确切的临床意义及应用前景，有助于将ASIC1作为靶点应用于肿瘤的早期诊断，并为肿瘤治疗提供新方向。