地塞米松体外下调Eomes表达抑制1型辅助性T细胞功能

(南华大学附属郴州医院1.转化医学研究所，2.肾内科，3.肝胆外科，湖南 郴州423000)

糖皮质激素在免疫系统中发挥强有效的调节作用[1]，可抑制多种免疫细胞如T细胞、肥大细胞等激活和趋化，诱导嗜酸性粒细胞凋亡，并抑制炎症部位一系列炎症介质的释放[2]。糖皮质激素在临床治疗炎症[3]和自身免疫疾病[4]的效果明确，而激素介导的免疫调节作用机制并未完全阐明。幼稚CD4+T细胞可分化为1型辅助性T细胞(Type 1 T helper cells，Th1)、Th2、Th17等细胞[5]。其中Th1细胞主要产生γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素2(Interleukin-2，IL-2)等细胞因子参与免疫应答[6]；Th2细胞参与细胞外病原体的清除[7-8]，Th17细胞通过产生标志性细胞因子介导炎症免疫应答[9]。本文通过地塞米松体外72 h处理外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，探讨其对健康人外周血辅助性T细胞亚群分布、增殖、凋亡、功能及转录水平的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集健康志愿者外周血，排除人类免疫缺陷病毒、梅毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒等感染性疾病，且近期未使用糖皮质激素的健康志愿者作为本次研究纳入对象。该研究在南华大学附属郴州市第一人民医院伦理委员会和志愿者知情同意下进行。本次研究对象共45例，其中男37例，女8例；年龄19～47岁，平均(30.10±5.77)岁。

1.2 主要试剂

LIVEDEAD为Intitrogen公司生产；鼠抗人趋化因子受体6(Chemokine receptor 6，CCR6)PE-Cyanine7 (11A9)、T盒转录因子(T-box expression in T cells，T-bet) PE (eBio4B10)、CXC趋化因子受体3(C-X-C chemokine receptor type3,CXCR3) PE-610 (CEW33D)、脱中胚蛋白(Eomesodermin，Eomes)-APC (WD1928)、CD3 FITC (UCH71)、CD3 APC-eFluor 780 (SK7)、细胞核相关抗原(nuclear-associated antigen ki-67，ki-67)-PE-eFluor 610(20Raj1)购自eBioscience公司；鼠抗人CD4 BUV-737 (SK3)、CD8 APC-CY7 (SK1)、IFN-γ PE-CF (B27)、Granzyme B PE (GB11)、膜联蛋白V(Annexin V)-PE凋亡检测试剂盒购自BD Biosciences公司；Cytofix/Cytoperm、Fixation/Permeabilization solution kit购自BD Biosciences公司；Fixation/Permeabilization Reagents、Human TruStain FcXTM(Fc Receptor Blocking Solution)、Foxp3/Transcription Factor 染色液试剂购自eBioscience公司；地塞米松、佛波酯(PMA)、离子霉素(Ionomycin)为Sigam-Aldricha公司生产。

1.3 仪器

应用MoFlo XDP流式细胞分选仪(美国Beckman公司)获取并分析细胞，软件FlowJo V10.0分析流式数据。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞准备 采集健康志愿者外周血6～10 mL，经淋巴细胞分离液梯度离心分离PBMCs，冻存液冻存于-196 ℃液氮罐中备用。细胞解冻后，加5 mL R1640培养基洗去冻存液，用1 mL含10%胎牛血清的R1640完全培养基(Gibco)重悬细胞，并置于48孔细胞培养板，37 ℃、5% CO2培养箱中过夜培养。细胞活性恢复后计数并将同一样本按1×106个细胞每孔，分为地塞米松组(终浓度为1×10-7mol/L)、对照组(细胞完全培养液培养)并种于96孔平底板中，放置细胞培养箱中72 h。

1.4.2 细胞表面染色 将上述样本转移至96孔V底板， 100 μL每孔live/dead (工作浓度1∶1 000)重悬，室温避光孵育30 min 。细胞染色时先染含5 % Human TruStain FcXTM抗体悬液25 μL每孔，4 ℃孵育5 min，以阻断Fc非特异性结合；按总体积50 μL每孔染相应的抗体CD3、CD4、CXCR3、CCR6、CD8混匀后，4 ℃孵育30 min，700×g离心4 min。凋亡检测时，据试剂盒说明书染Annexin V、7-AAD抗体，常温孵育15 min，400 μL试剂盒相应缓冲液重悬后，一小时内检测。

1.4.3 胞内细胞因子刺激 PBMCs用地塞米松处理72 h后转移至96孔U底板，用PMA (50 ng/mL)加Ionomycin (1 μg/mL )再刺激4～6 h，其中刺激细胞1 h后加Golgistop(工作浓度1∶1 500)阻断胞内细胞因子释放到胞外，5 h后检测胞内细胞因子表达。

1.4.4 胞内细胞因子染色 因PMA刺激会导致CD4+T细胞表达减少，因而使用CD8-T细胞群反设门为CD4+T细胞。Fixation/Permeabilization solution 100 μL每孔重悬细胞后4 ℃避光孵育20 min，洗涤细胞两次后，按上述染色步骤，染抗IFN-γ、GzmB抗体，并流式检测。

1.4.5 核内转录因子染色 细胞经表面抗体染色后，使用Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer 100 μL每孔室温避光孵育40 min。洗涤细胞后，按上述染色步骤，染抗T-bet、Eomes或ki-67抗体，并流式检测。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 地塞米松体外处理增加CD4+T细胞的频数

复苏健康人PBMCs 23例，按照细胞数1×106个每孔，将同一细胞分为对照组与地塞米松处理组。地塞米松处理PBMCs 72 h后，PBMCs经流式抗体表面染色检测发现：与对照组相比，地塞米松处理增加CD4+T细胞的比例(P<0.01，表1)。

表1 地塞米松处理组与对照组各表型的比例 (%)

与对照组比较，aP<0.01,bP<0.05

2.2 地塞米松体外处理改变辅助性T细胞的分布

为明确地塞米松体外72 h处理对CD4+T细胞亚群的影响，进一步分析Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞的比例变化(图1，表1)时发现：与对照组相比，地塞米松刺激后可使Th2、Th17细胞比例显著增加(P<0.05)，而Th1细胞显著降低(P<0.01)。

2.3 地塞米松体外处理抑制Th1细胞的功能

PBMCs经佛波酯和离子霉素体外再刺激6 h后，流式抗体胞内细胞因子染色(图2)分析发现：地塞米松刺激Th1细胞后，其功能性因子IFN-γ和GzmB的表达显著减少(P<0.01，表1)。

2.4 地塞米松体外处理对Th1细胞增殖与凋亡的影响

细胞破核染色后检测增殖标记ki-67的表达情况，发现地塞米松处理对Th1细胞表达ki-67的比例变化无统计学差异(图3A，表1)。细胞刺激72 h后直接染Annexin V、7-AAD抗体检测细胞凋亡情况，发现地塞米松处理后Th1细胞上早期凋亡细胞比例无明显差异，晚期凋亡细胞比例显著增加(P<0.05，图3B，表1)。

图1 地塞米松影响辅助性T细胞亚群分布辅助性T细胞的流式设门策略，CXCR3+CCR6-定义为Th1细胞、CXCR3-CCR6-定义为Th2细胞、CXCR3-CCR6+定义为Th17细胞(n=23)

2.5 地塞米松体外处理抑制Th1细胞的转录

PBMCs经核内染色(图4)，发现地塞米松处理后Th1细胞表达转录因子T-bet无统计学差异，而Eomes表达显著减少(P<0.01，表1)，且Eomes/T-bet比值也显著下调(P<0.01，表1)。

图2 地塞米松对Th1细胞上功能性细胞因子IFN-γ、GzmB表达的影响A：Th1细胞上IFN-γ表达的典型流式图(n=11)；B：Th1细胞上GzmB表达的典型流式图(n=11)

图3 地塞米松对Th1细胞增殖、凋亡的影响A：Th1细胞上ki-67表达的典型流式图(n=11)；B：Th1细胞早期凋亡(Annexin V+7-AAD-)，晚期凋亡细胞(Annexin V+7-AAD+)的典型流式图(n=10)

图4 地塞米松对转录因子T-bet、Eomes表达的影响A：Th1细胞上T-bet表达的典型流式图(n=11)；B：Th1细胞上Eomes表达的典型流式图(n=11)

3 讨 论

在本文中，与对照组相比，地塞米松体外72 h处理增加CD4+T细胞的比例，显著减少Th1细胞，增加Th2、Th17细胞的比例。有研究发现地塞米松可抑制Th1细胞免疫，促进Th2细胞免疫应答[10]，Zhao等[11]研究也证实，在体外实验中地塞米松可增加Th17细胞的频率。表明地塞米松可改变细胞亚群的比例，减少Th1细胞、并促进CD4+T细胞向Th2、Th17细胞分布。

T-bet、Eomes为调控Th1细胞分化的主要转录因子，T-bet高表达于Th1细胞，调节Th1细胞分化并促进IFN-γ的表达。体外实验中激活的Th1细胞也可表达Eomes[12]，当T-bet缺失时，Eomes对IFN-γ的产生以及Th1细胞的发育起重要的调节作用。而Th1细胞可诱导GzmB表达，GzmB作为胞外蛋白酶在介导细胞凋亡过程中起重要作用，胞外GzmB的高表达与多种炎症性疾病明显相关[13-14]。有研究表明转录因子T-bet、Eomes的表达与调节编码效应细胞因子如IFN-γ，以及编码重要细胞溶解功能如穿孔素、GzmB的基因表达有关[15]。

检测功能性因子的表达情况发现：地塞米松体外处理后，Th1细胞IFN-γ、GzmB表达减少。有研究证实地塞米松显著减少IFN-γ的表达[3]，地塞米松也可阻断GzmB的合成以及激活并影响其活性[16]。IFN-γ、GzmB是Th1细胞的功能性细胞因子，提示地塞米松72 h处理可抑制Th1细胞的功能，从而使得Th1细胞功能受损。

Ki-67是表达于细胞周期G1、G2、S期，但不表达于M期的核抗原，已被广泛用作细胞增殖的标志。细胞凋亡是一个调控良好的细胞死亡过程，在细胞稳态的发育和维持中具有重要作用，Annexin V和7-AAD常用于鉴定细胞凋亡。本研究检测细胞增殖和凋亡的实验结果表明，地塞米松体外处理不影响Th1细胞的增殖，但能显著促进Th1细胞的凋亡，与Kailin Xing 等[17]研究结果一致。

T-bet、Eomes是Th1细胞的主要转录因子，紧接着检测转录因子水平的变化发现：地塞米松72 h处理后，Th1细胞上T-bet的表达无明显改变，但Eomes的表达以及Eomes/T-bet的比值显著减少。已有研究表明：炎性条件下，地塞米松可降低T-bet mRNA的表达水平[18]。而T-bet也参与调控滤泡辅助性T细胞(Follicular help T cell，Tfh)分化、发育，本研究中Th1细胞T-bet的表达无明显改变可能是地塞米松作用于除Th1细胞之外的另一群细胞如Tfh细胞，主要减少其T-bet的表达，该猜想仍需进一步研究证实。Eomes、Eomes/T-bet的比值在Th1细胞中显著降低，提示地塞米松可抑制Th1细胞的转录水平，打破Eomes与T-bet之间的转录平衡，使得Th1细胞转录功能受损。转录因子T-bet、Eomes调节IFN-γ、GzmB表达，而IFN-γ又可调控转录因子的表达，故转录水平受损将影响特异性细胞因子的表达，而特异性细胞因子受抑制后又可反过来影响转录因子的表达[19]。

综上所述，地塞米松体外干预健康人外周淋巴细胞可促进Th1细胞凋亡从而减少Th1细胞的比例，抑制其转录因子Eomes的表达，并破坏转录因子T-bet和Eomes之间的转录平衡，进而抑制Th1细胞的功能。本文结果显示，在健康人群中地塞米松72小时干预对Th1细胞比例、功能性细胞因子的分泌乃至转录水平的影响，为探讨地塞米松的免疫调节机制提供参考。