串联质谱检测苯丙氨酸浓度在筛选新生儿苯丙酮尿症中的应用

(西安交通大学第一附属医院儿科, 陕西 西安 710000)

新生儿疾病筛查是指对新生儿进行先天性疾病及遗传性疾病进行群体筛检，以保障儿童正常的体格和智能发育。苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种常染色体隐性遗传代谢性疾病，是由于体内苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)活性降低导致苯丙氨酸向酪氨酸代谢受阻，从而导致患儿智力低下和生长发育缓慢。在我国，患儿苯丙酮尿症的发病率已达0.01%[1]，已列为新生儿常规检查项目之一。苯丙酮尿症可被治疗，通过对新生儿开展主要疾病筛查工作，进而提高治愈率，以防止严重后果的发生[2-3]。而MS/MS是一种灵敏度和特异性均很高的快速分析法, 可实现样本中多种目的样的同时测定，并且能够将诊断的假阴性和假阳性率大大降低。本文主要研究MS/MS在筛查新生儿苯丙酮尿症中的效果，现将结果整理如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2011年3月至2015年12月共采集标本9000例，健康新生儿组男6000例，女2998例，共8998例，临床疑似PKU患者2例。(Phe和Tyr的正常值范围是通过检测健康婴幼儿血中PHe和Tyr的浓度来确定的。)临床表现为智力相对于健康婴儿偏低。按《新生儿疾病查技术规范》[4]采集样本。标本来源于出生大于3天，哺乳至少达到3次的婴儿，于足跟部采血，用专用滤纸收集采集到的血样，自然干燥，然后将其置于塑料袋内，为保证不被污染需将其进行封口并保存于-20 ℃冰箱中于一周内检验即可。

1.2 仪器和试剂

PKU 检测指标为新生儿干滤纸血片样本中的Phe和Tyr浓度，采用MS/MS检验分析法，所用的高效液相色谱串联质谱仪购自美国Applied Biosystems公司，型号为3200QTRAP。MS/MS所用到的非衍生化试剂盒购自美国Millipore公司。实验中所用到的Phe和Tyr标准品均来自美国sigma公司。

1.3 MS/MS法

测定前先用打孔器将采血滤纸打成3 mm的圆形滤纸，将其置于96孔板中，每孔加入用Phe和Tyr同位素标记的甲醇溶液100 L，密封，45 ℃以650转/分钟的速度振荡50 min，室温放置30 min后转移80 L置于另一个新的96孔板中上样检测。检测时将自动进样设置为每次进样20 L，测定时选择多反应监测模式，每个样品的测试时间约为2 min。

1.4 资料分析

采用定量分析软件ChemoView1.0, 根据Phe 和Tyr同位素标记和离子峰强度，根据标准品做出标准曲线，然后再计算出相应样品Phe和Tyr的浓度。

1.5 结果判定

通过检测健康新生儿血液中Phe和Tyr浓度，并根据本科室检测的具体情况，将新生儿样本干滤纸血片中的 Phe 浓度阳性切值定为120 mol/L，同时Phe/Tyr的比值要大于等于3.5。即测得血 Phe浓度≥120 mol/L时Phe/Tyr的比值大于等于3.5，则需召回病例进行复查，若Phe仍大于120 mol/L，且Phe/Tyr的比值大于3.5。则可认为是可疑 PKU 阳性病例。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 线性范围

MS/MS法检测Phe的线性范围为 25.3～898.5 mol/L，Tyr的线性范围为39.60～260.07 mol/L，经统计学分析新生儿患者在男、女之间Phe和Tyr的浓度均无显著性差异(P=0.345)

2.2 平均回收率和变异系数

MS/MS法检测新生儿血中Phe浓度的平均回收率为97.8%, Tyr浓度的平均回收率为96.5%，具体指标见下表(表1)。

表1 MS/MS法检测新生儿血中Phe和Tyr的回收率及变异系数 (%)

2.3 健康新生儿和临床疑似PKU新生儿全血Phe和Phe/Tyr比值的比较

MS/MS法检测健康新生儿全血Phe的浓度为(43.5±2.1) mol/L，经MS/MS法检测，最终确定PKU阳性2例，其PHe，Tyr及两者比值见下表(表2)。同时计算得健康新生儿全血Phe/Tyr<3.5, 阳性PKU组Phe/Tyr>3.5。

表2 MS/MS法显示PKU新生儿患者Phe，Tyr及两者比值

注：标本号 “1、2”代表PKU阳性的2例患者

3 讨 论

PKU是一种常染色体隐性遗传代谢性疾病，是由于体内PAH活性降低导致苯丙氨酸向酪氨酸代谢受阻，导致血液中甚至尿中的苯丙氨酸浓度升高，而高浓度的苯丙氨酸会影响脑部发育，导致患儿智力低下和生长发育缓慢。PKU又称为苯丙氨酸羟化酶缺乏症(phenylalanine hydroxylase deficiency)，是氨基酸代谢性疾病中最常见的类型，苯丙氨酸满足人体生长和代谢的需要，但高浓度的苯丙氨酸，及低浓度的酪氨酸都将严重影响患儿的正常生长和发育。全球发病率约为1/1.5万，随民族和地区而不同，而我国的发病率已经达到了0.1%。其临床症状一般为：患儿在刚出生时一般会表现为正常，但是也存在一些患儿会出现喂养困难、呕吐、脾气暴躁易发怒等非特异性症状，但伴随着进奶后血中苯丙氨酸及其代谢产物的升高，到3～5个月开始会表现出生长缓慢，皮肤苍白的症状，并且由于合成的黑色素减少，患儿的头发会由黑色逐渐转变为黄色，并且经患儿排出的汗液及尿液中有特殊的鼠臭味，伴有湿疹[5]。但是该病若在早期发现并给予积极治疗的话，儿智力发育可以完全正常，是少数几种可以通过早期诊断、治疗预防其智能障碍出现的疾病之一[6]。

研究证明，全血中苯丙氨酸的浓度对于PKU 的早期筛查，诊断和治疗等具有极其重要的意义[7,8]。PKU的筛查和检验的方法有多种，目前主要包括细菌抑制法，荧光法，比色法，高效液相色谱法，MS/MS法，高效毛细管电泳法等[9,10]。相对于其他方法，MS/MS的最大优势就是能够将诊断的假阴性和假阳性率大大降低, 它的实现主要取决于MS/MS在特异性和灵敏度方面的显著优势, 而只有对其进行方法学考核才能够确保这些优势能实际应用于临床实践。实施考核时, 应该重点考察方法的特异性、重复性和准确度。其次应该进行方法验证。取一定已知结果的阳性和阴性样本, 打乱后应用MS/MS法进行分析, 然后将谱筛查结果同已知结果进行对比，来对方法进行验证。

由于MS/MS可最大程度的减少假阳性率，故目前多采用这种方法对新生儿苯丙酮尿症进行筛选。本研究中，我们采用MS/MS对血中Phe浓度进行了测定，此法显示出高效、快速、灵敏度高，特异性好，检测时间短，不需衍生化处理。线性范围宽，精密度高，重复性好，用血量少，在临床上，尤其对新生儿苯丙酮尿的筛选意义重大，有助于其早期诊断，可提高其治愈率。但由于样本量有限，该实验结果有待进一步验证。尽管MS/MS有很多优势，但并不能完全取代传统的筛查方法。随着其日益成熟，MS/MS将有可能为更多的疾病进行分析筛查。