转铁蛋白受体靶向多肽载体合成条件的优化*

李松涛，赵红玲，常安琪，祁 麟

（承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000）

研究表明，转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）在一些肿瘤细胞表面呈现过表达现象，而在正常细胞表达量很低[1-2]，这种差异化表达提示TfR可能成为肿瘤治疗的作用靶点。噬菌体展示技术是筛选肿瘤靶向多肽的主要方法之一[3]。DAI等[4]利用噬菌体展示技术筛选到一条对TfR具有高亲和力的多肽BP9，随后他们又制备了一种BP9氮末端连接麻风树毒蛋白的融合蛋白，并发现该融合蛋白对肝癌细胞具有显著的增殖抑制活性，而对正常肝细胞没有影响[5]，这一结果提示BP9可能成为肿瘤细胞靶向给药的载体。

本课题组前期研究设计并合成了一种BP9氮末端连接半胱氨酸的类似物BP9a，通过引入活性反应基团巯基实现BP9的靶向载体功能。本文进一步对BP9a固相合成条件中的缩合体系和裂解试剂进行优化，以期提高BP9a粗肽的纯度和收率，并为肿瘤细胞靶向多肽的规模化制备提供依据。

1 仪器、试剂与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器：U3000型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司）；Heal Force纯水机（香港力康公司）；TDL-40B型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；AR224CN型分析天平（美国奥豪斯仪器上海有限公司）；DF-101S型加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.1.2 试剂：2-CTC树脂（天津南开合成科技有限公司，取代度1.3mmol/g）；Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH（成都诚诺新科技有限公司）；O-苯并三氮唑-N, N, N", N"-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、1-羟基苯并三唑（HOBt）（苏州中科天马肽工程中心有限公司）；N, N"-二异丙基碳二亚胺（DIC）、N,N"-二异丙基乙胺（DIPEA）（苏州昊帆生物科技有限公司）；三氟乙酸（TFA，百灵威科技有限公司）；苯甲醚（Anisole）、苯甲硫醚（Thioanisole）（上海晶纯试剂有限公司）；1，2-乙二硫醇（EDT）（美国Amresco公司）；三异丙基硅烷（TIS，上海邦成化工有限公司）；苯酚（Phenol）、N，N"-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、哌啶、乙醚等均为市售分析纯试剂；甲醇和乙腈为市售色谱纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 BP9a全保护肽树脂的制备：以2-CTC树脂为固相载体，DIC/HOBt或HBTU/DIPEA为缩合体系，应用Fmoc/tBu交叉保护策略，按照多肽固相合成法[6]合成BP9a全保护肽树脂。

称取2-CTC树脂（1g，1.2mmol）用DMF溶涨、洗涤，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH（1.38g，3.6mmol）、DIPEA（0.72 ml，3.6mmol），室温反应1h后抽掉反应液，DMF洗涤树脂，得到Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂。加入30ml封闭液（DCM：甲醇：DIPEA=80:15:5，V:V）封闭2次，每次10min，抽干封闭液，DMF洗涤树脂。向上述Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂中加入含20%哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基团，再加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH（2.33g，3.6mmol）和缩合试剂，室温反应一定0.7～1.5 h，抽掉反应液，DMF洗涤树脂。按照BP9a的肽序列，重复上述脱Fmoc保护与氨基酸偶联步骤，依次连接Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH，脱除N末端Cys的Fmoc保护基后，肽树脂经甲醇（20 ml）收缩两次，每次10min，真空减压干燥至恒重，得BP9a肽树脂。

1.2.2 裂解与沉降：称取“1.2.1”中的BP9a全保护肽树脂0.1g，加入1ml裂解试剂，0℃反应30min后再升至室温反应2h，滤除树脂，用少量TFA洗涤树脂，合并滤液并缓慢加入到10倍于滤液体积的冰乙醚沉降，离心后弃去上清液，将沉淀用冰乙醚洗涤三次，真空减压干燥至恒重，得BP9a粗品。

1.2.3 粗肽纯度分析：HPLC分析条件：Innoval C18色谱柱（4.6mm×250mm，5 m）；流动相：A，0.1% TFA/水；B，0.1%TFA/乙腈，洗脱梯度（0→20min：B 5%→95%）；流速：1ml/min；检测波长215nm；柱温30℃。

2 结果与分析

2.1 缩合体系的优化 HBTU/DIPEA和DIC/HOBt是固相多肽合成中常用的两种缩合体系，且前者偶联氨基酸的效率通常要高于后者。本研究在BP9a全保护肽树脂合成过程中分别使用HBTU/DIPEA和DIC/HOBt两种缩合体系偶联氨基酸，通过比较上述两种缩合体系对氨基酸偶联时间、合成完毕后得到肽树脂的增重量及肽树脂裂解后所得粗肽纯度的影响，以确定所使用的缩合体系。结果见表1：DIC/HOBt缩合体系偶联氨基酸的反应时间比HBTU/DIPEA缩合体系长，但使用DIC/HOBt作为缩合体系得到的BP9a肽树脂的增重量与肽树脂经裂解后得到的粗肽纯度均高于后者，较高的粗肽纯度可以简化后续的纯化过程，更有利于得到高纯度、高收率的精肽，因此本研究选择DIC/HOBt缩合体系作为氨基酸的偶联试剂。

表1 两种缩合体系比较

2.2 裂解体系优化 在固相多肽合成过程中，肽树脂的裂解是重要步骤之一，直接影响精肽的纯度和收率。Fmoc/tBu保护策略的多肽固相合成，切肽和脱除侧链保护基时可采用弱酸。TFA为应用最广泛的弱酸试剂，它可以脱除t-Bu、Boc等侧链保护基团，且条件温和、副反应较少。BP9a肽树脂合成过程中所使用的氨基酸侧链保护基团有tBu、Pbf和Trt，针对这些保护基团，本研究考察了5种常用的裂解试剂切肽后对粗肽纯度的影响。称取BP9a肽树脂0.1g，加入相应裂解试剂各1ml，按1.2.2的裂解与沉降操作得到相应的粗肽并称重，按照1.2.3的HPLC分析方法测定5种裂解条件下得到粗肽的纯度，根据公式计算各个裂解条件下得到粗肽的相对收率。5种裂解试剂对BP9a粗肽纯度和相对收率的影响结果见表2，配比为TFA: EDT : H2O : TIS ( 94: 2.5: 2.5: 1, V : V ) 的裂解试剂切肽后得到BP9a粗肽的纯度和收率最高。因此，配比为TFA: EDT : H2O : TIS ( 94: 2.5: 2.5: 1, V : V ) 的裂解试剂组合最适合本文BP9a肽树脂的裂解反应。

表2 不同裂解试剂的比较

3 小结

本文对肿瘤细胞转铁蛋白受体靶向多肽类似物BP9a的固相合成条件进行了优化。优化后的缩合体系和裂解试剂组合分别为DIC/HOBt和TFA:EDT:H2O:TIS(94:2.5:2.5:1, V:V)，在上述优化的合成条件下得到粗肽的纯度和相对收率均最高。本研究可为肿瘤细胞靶向多肽载体的规模化制备提供借鉴。