丝胶对2型糖尿病大鼠胰腺Akt的调节作用*

刘东慧，刘陈霏，宋妤轩，阮鸿娇，陈志宏△

（1.承德医学院人体解剖学教研室，河北承德 067000；2.中国药科大学）

2型糖尿病是一种由胰岛素相对或绝对分泌不足导致的以血糖升高为主要临床表现的代谢性疾病。在胰腺，胰岛素由胰岛β细胞分泌后与胰岛素受体(insulin receptor，IR)结合而启动磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phos-phatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路，启动后的PI3K/Akt信号通路通过调控胰岛素分泌，维持β细胞的生长、增殖等途径来实现胰岛素降低血糖的作用[1-2]。丝胶是从蚕茧中提取的一种天然水溶性蛋白，具有生物相容性，可降解。Akt作为PI3K/Akt信号通路中的关键因子之一，本研究在前期发现丝胶能有效降低血糖的基础上[3]，进一步观察了丝胶对2型糖尿病大鼠模型胰腺Akt mRNA表达的调节作用，以期揭示丝胶降血糖的作用机制。

1 材料与方法

1.1 丝胶的提取 蚕茧经1%的Na2CO3浸泡30min后沸煮3h(2次)，将提取液浓缩、透析冻干至粉末备用。

1.2 动物分组及处理 SPF级雄性SD大鼠，实验动物许可证号：SCXK(京)2012-0001，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。36只大鼠随机分为正常组、模型组和实验组，每组12只。给予造模大鼠高脂高糖饲料+腹腔注射STZ(35mg/kg/d，连续2d)处理，以空腹血糖≥11.1mmol/L的大鼠为成功2型糖尿病大鼠模型。成模后，实验组大鼠给予丝胶(2.4g/kg/d)连续灌胃35d，正常组、模型组大鼠给予等体积生理盐水连续灌胃35d。用药结束，将各组大鼠麻醉后，取血、处死，迅速取出胰腺加入Trizol放于液氮中研磨，研磨充分后放液氮中储存备用。

1.3 检测血糖 将取得的各组大鼠血液标本离心、分离血清后送承德医学院附属医院检验科检测血糖。

1.4 检测胰腺Akt mRNA的表达 采用Real Time Q-PCR法：取适量胰腺组织提取总RNA并反转录为cDNA备用。利用pGM-T质粒载体成功构建Akt和GAPDH标准品后测定其浓度用以后续定量。扩增各组大鼠的Akt和GAPDH得标准曲线、扩增曲线、溶解曲线，PCR引物设计与合成由宝生物工程(大连)有限公司完成，以Akt与相应GAPDH拷贝数的比值作为各组大鼠Akt mRNA的相对表达水平，PCR引物序列见表1。

表1 引物序列和产物大小

1.5 统计分析 各组大鼠血糖及胰腺Akt mRNA的表达均以（±s）表示，采用IBM SPSS Statistics 24.0统计学软件处理数据，多组间差异的比较采用单因素方差分析，两两组间差异采用Tukey’s检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血糖水平 模型组大鼠血糖明显高于正常组大鼠(P＜0.05)，实验组大鼠血糖明显低于模型组大鼠(P＜0.05)。见表2：

表2 各组大鼠的血糖及胰腺Akt mRNA的表达水平（±s ）

表2 各组大鼠的血糖及胰腺Akt mRNA的表达水平（±s ）

与模型组比较：*P＜0.05

组别 n 血糖(mmol/L) Akt mRNA正常组 12 10.83±2.03* 58.14±16.39*模型组 12 29.45±4.82 28.83±8.06实验组 12 13.20±4.09* 46.37±12.57*

2.2 胰腺Akt mRNA的表达 Akt标准品浓度梯度为1.57×107～1.57×104，以pGM-T-Akt阳性质粒DNA和各组大鼠cDNA做为模板，经过Real Time Q-PCR法扩增后得到的标准曲线扩增效率为94.859%，斜率为-3.452，相关系数r为-0.998，截距为36.253；扩增曲线均呈S型；溶解曲线呈单峰（附图）。各组大鼠Akt mRNA表达的定量分析结果见表2：模型组大鼠Akt mRNA的表达量明显低于正常组大鼠(P＜0.05)，实验组大鼠Akt mRNA的表达量明显高于模型组大鼠(P＜0.05)。

（1.标准曲线，2.扩增曲线，3.溶解曲线）

3 讨论

目前，2型糖尿病的发病率逐年增高，已经成为全球关注的公共健康问题，临床用于治疗糖尿病的各类药物虽能有效降低血糖，但长期服用均会产生不良反应。因此，探寻一种天然药物来弥补目前降糖药的不足十分必要。丝胶来源于蚕茧，课题组前期发现丝胶能有效降低血糖[3]，但机制尚不明了。

胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，与IR结合后启动PI3K/Akt信号通路，从而激活Akt。活化的Akt通过调控与细胞周期相关的酶来维持胰岛β细胞的细胞周期，促进β细胞增殖[4-5]；活化的Akt可使凋亡基因失活，抑制β细胞凋亡[6]；活化的Akt还可调节β细胞分泌胰岛素，促进外周靶组织摄取葡萄糖，减轻胰岛素抵抗[7]。有研究发现，Akt激酶失活的转基因小鼠，其胰岛β细胞Akt活性明显下降，进而出现胰岛素分泌缺陷[8]。因此，在胰岛β细胞的生长、增殖、再生、凋亡及分泌胰岛素中，PI3K/Akt信号通路发挥着十分重要的作用。

本研究发现，模型组大鼠胰腺Akt mRNA的表达明显降低。Akt是PI3K/Akt信号通路中的关键因子之一，其表达降低可通过影响β细胞的增殖、凋亡及胰岛素的分泌而导致胰岛素的生理作用减弱，从而引发模型组大鼠血糖明显升高。实验组大鼠给予丝胶灌胃后，Akt mRNA的表达明显升高，提示丝胶可通过上调胰腺Akt mRNA的表达，改善糖尿病时胰岛β细胞中PI3K/Akt信号转导通路的异常，从而发挥降低血糖的作用，这可能是丝胶降低血糖的作用机制之一。