林蛙皮银耳保湿霜的制备

陈海燕， 孙志双， 刘美含， 朱彩凤， 施溯筠

( 延边大学 药学院， 吉林 延吉 133002 )

0 引言

中国林蛙(Ranachensinensisdavid)又称哈什蟆，属两栖纲无尾目蛙科蛙属[1]，是集食补、药用、美容等功能于一体的珍稀动物.目前，对林蛙的研究与应用主要集中于林蛙油和林蛙卵，而有关林蛙皮的则很少.研究[2]表明，林蛙皮中天然保湿因子透明质酸、胶原蛋白等含量较高，同时对修复微创面、恢复皮肤屏障具有很好的效果[3].银耳(Tremella)是银耳科银耳属门担子菌门真菌银耳的子实体[4].银耳多糖作为银耳主要的活性成分之一，不仅具有优良的保湿功效，而且可改善皮肤纹理度，降低皮肤粗糙度，增加皮肤弹性，可作为功效性成分应用于化妆品中[5].

在护肤市场中，保湿功效类护肤品一直深受消费者青睐.查阅文献发现，有将林蛙皮或银耳为原料制成护肤品的报道[2,4-7]，但未发现有将林蛙皮和银耳共同作为原料制成护肤品的报道.鉴于此，本实验以林蛙皮和银耳多糖为主料，通过响应面分析法优化保湿霜的基质处方，并用皮肤角质层的水分含量评价该处方的保湿效果.

1 实验仪器与材料

UV-2201型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司； HH-6型数显恒温水浴锅，金坛市科技仪器有限公司； FA-2004电子天平，上海良平仪器仪表有限公司； Z-36HK高速台式离心机，天津市医疗器械厂； pHSJ-4F雷磁型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司； ZK-2S真空干燥箱，北京中兴伟业仪器有限公司； DHG -9145A型电热鼓风干燥箱，常州诺基仪器有限公司； SK-III数字皮肤水分测试仪，深圳凯尔电子有限公司； Laisen多功能活氧解毒机，厦门市莱森电子有限公司.

三乙醇胺，抚顺佳化化工有限公司生产；甘油，益海嘉里投资有限公司生产；单硬脂酸甘油酯，广州市佳力士食品有限公司生产；棕榈酸异辛酯，山东优索化工科技有限公司生产；卡波姆940，山东优索化工科技有限公司生产；其他试剂均为分析纯.

新鲜林蛙皮来自长白山辉煌生物科技有限公司，在-80 ℃冷冻备用；银耳购于延吉市西市场.

2 实验方法

2.1 林蛙皮及银耳的加工处理

2.1.1林蛙皮极细粉的制备 将林蛙皮剪切成3 cm×2 cm的薄片.采用复合脱腥法[8](臭氧脱腥法[9]、β-环糊精法[10]和茶汤吸附法[9])对林蛙皮进行脱腥处理.采用H2O2法[11]脱色.将脱色后的林蛙皮置于真空干燥箱中干燥(80 ℃，3 h),然后粉碎过200目筛，得到林蛙皮极细粉.

2.1.2银耳多糖的制备 将50 g银耳子实体粉碎后过60目筛，加蒸馏水(料液比为1∶40)，在80 ℃水浴加热提取3.5 h，冷却后4 000 r/min离心10 min.将上清液浓缩至300 mL，用乙醇(体积比为1∶4)在4 ℃下沉淀12 h， 4 000 r/min离心10 min.除去上清液得到沉淀，取200 mL蒸馏水将其溶解，用Sevage法除去蛋白，得200 mL银耳多糖提取液，备用.采用硫酸-苯酚法[12]测定银耳多糖的含量.

2.2 林蛙皮银耳保湿霜的配方

根据相关文献[13]，结合预实验初步确定保湿霜的基本配方如表1所示.

表1 林蛙皮银耳保湿霜的配方

2.3 保湿霜的制备工艺

将卡波姆940用蒸馏水预先溶解，然后加入甘油，在45 ℃水浴中加热搅拌直至甘油完全溶解.将B相水浴加热至80 ℃溶解，搅拌条件下将A相加入B相并搅拌45 min以上；自然冷却至45 ℃后，加入C相水浴恒温(45 ℃)搅拌20～25 min，加入D相继续搅拌至室温，成霜体后装瓶密封保存.

2.4 各项指标检测

2.4.1外观性状 观察样品色泽是否均匀，有无明显的麻点，是否细腻易涂抹.1～2分为色泽不均匀，有明显颗粒感，不易涂抹； 3～4分为色泽不均匀，有颗粒感，不易涂抹； 5～6分为色泽较均匀，颗粒感不明显，涂抹效果一般； 7～8分为色泽较均匀，颗粒感不明显，涂抹效果良好； 9～10分为色泽均匀，无颗粒感，涂抹效果极佳.

2.4.2乳化稳定性 取样品0.1 g加入50 mL去离子水，50 ℃下搅拌均匀，冷却至室温；以水作参比，测定其在380～800 nm范围内的最低透光率.透光率越低表示乳化越稳定.透光率为0.8～1，为0～2分；透光率为0.6～0.8，为2～4分；透光率为0.4～0.6，为4～6分；透光率为0.2～0.4，为6～8分；透光率为0～0.2，为8～10分.

2.5 单因素实验

2.5.1单硬脂酸甘油酯添加量对膏剂制备的影响 在棕榈酸异辛酯用量4%、三乙醇胺用量0.8%、甘油用量8%、乳化时间45 min条件下，以单硬脂酸甘油酯作为单因素，选取不同水平单硬脂酸甘油酯的用量(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%)进行实验，以此确定单硬脂酸甘油酯的最佳用量.

2.5.2棕榈酸异辛酯添加量对膏剂制备的影响 在单硬脂酸甘油酯用量3%、三乙醇胺用量0.8%、甘油用量8%、乳化时间45 min条件下，以棕榈酸异辛酯作为单因素，选取不同水平棕榈酸异辛酯的用量(2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%)进行实验，以此确定棕榈酸异辛酯的最佳用量.

2.5.3三乙醇胺添加量对膏剂制备的影响 在单硬脂酸甘油酯用量3%、棕榈酸异辛酯用量4%、甘油用量8%、乳化时间45 min条件下，以三乙醇胺作为单因素，选取不同水平的三乙醇用量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)进行实验，以此确定三乙醇胺的最佳用量.

2.5.4甘油添加量对膏剂制备的影响 在单硬脂酸甘油酯用量3%、棕榈酸异辛酯用量4%、三乙醇胺用量0.8%、乳化时间45 min条件下，以甘油作为单因素，选取不同水平甘油的用量(2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%)进行实验，以此确定甘油的最佳用量.

2.5.5林蛙皮极细粉和银耳粗多糖提取液的添加量对膏剂制备的影响 参考文献[14]选取不同林蛙皮极细粉的用量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)和银耳粗多糖提取液的用量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)进行实验，以此确定林蛙皮极细粉和银耳粗多糖提取液的最佳用量.

2.6 响应面实验

根据Box-Benhnken模型的中心组合试验设计原理，选取单因素实验中对保湿霜影响较大的3个因素(棕榈酸异辛酯(A)、三乙醇胺(B)、甘油(C))作为自变量，并通过确定3个因素水平的最佳参数来进行响应面分析，因素及水平见表2.

表2 响应面分析因素及水平

2.7 皮肤角质层水分含量的测试

按照自愿原则选择20～30岁无皮肤病史及化妆品过敏史的10名受试者进行皮肤短期保湿性试验.测试条件：环境温度(25±1) ℃，相对湿度(40±5)%.测试前受试者需在测试条件下至少稳定30 min，测试期间不能喝水和剧烈活动，不得使用其他同类产品.实验过程中左右前臂(暴露状态)内侧标记(2 cm×2 cm)试验区域，区域间隔1 cm.测试样品和空白对照均随机分布在左右前臂内侧.样品用量为(2.0±0.1) mg/cm2.使用皮肤水分测试仪测定标记点在样品使用前和使用后每隔30 min皮肤角质层的水分含量，直到180 min后停止测试，同时记录所有的测试数据(单位为au.).

3 结果与分析

3.1 单因素实验结果

林蛙皮银耳保湿霜的单因素实验结果如图1所示.单硬脂酸甘油酯含量在1%～5%时，保湿霜色泽均匀，但用量过多或过少会使其乳化稳定性变差，因此将3%的单硬脂酸甘油酯作为最佳用量.棕榈酸异辛酯含量过少时保湿霜不易涂抹，含量过多则变得油腻，并且棕榈酸异辛酯含量在4%和5%时的涂抹效果相差不大.因此考虑经济性选择4%的棕榈酸异辛酯作为最佳用量.三乙醇胺含量过多或过少均会降低保湿霜的稳定性，因此选择0.8%的三乙醇胺作为最佳用量.甘油含量过低保湿霜不易涂抹，含量过高则变得油腻，因此选择8%的甘油作为最佳用量.

由图1可知，林蛙皮极细粉和银耳粗多糖提取液在质量分数为1.0%～3.0%时均有明显的保湿作用.和基质共同作用时，林蛙皮极细粉含量为1.5%和银耳粗多糖提取液含量为2%时所制得的保湿霜的涂抹分散性及稳定性最好.

图1 单因素实验

3.2 响应面实验结果

3.2.1响应面实验设计 依次改变棕榈酸异辛酯(A)、三乙醇胺(B)、甘油(C)的用量，以保湿霜的综合评分作为指标，采用响应面分析法对工艺参数进行优化.实验设计和结果见表3.

表3 响应面实验设计及结果

3.2.2拟合模型与显著性检验 根据表3的数据，可得表4所示的回归方程方差分析表.利用软件Design-Expert 8.0.6进行非线性回归的二次多项式拟合，得如下预测模型：

Y=9.35-0.91A-0.16B-0.1C-0.17AB-0.095AC-0.08BC-0.085A2-0.55B2-0.87C2，其中Y为保湿霜综合评分.

表4 回归方程模型方差分析表

注：P<0.05表示差异显著；P<0.001表示差异极显著.

由表4可知：棕榈酸异辛酯的P<0.000 1，达到极显著水平；三乙醇胺的P=0.057 6，甘油的P=0.192 0，均为统计显著性.由此得出各因素对综合评分的影响顺序是：A(棕榈酸异辛酯)>B(三乙醇胺)>C(甘油).根据回归方程，二次项中AB、AC、BC3项的P值均大于0.05，说明因素之间的交互作用不显著，各实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系.在二次项中A2、B2、C2的P值均小于0.001.依此配方，进行3次实验，实验所得综合评分为9.19.

图2—图4为各因子交互作用的响应面分析图和等高线分析图.通过考察所拟合的响应曲面的形状，可分析A、B、C的添加量对保湿霜综合评价的影响.等高线的形状趋于圆形表示2个因素之间交互作用不显著，趋于椭圆形则相反.由图2—图4中的响应面的最高点和等高线可以看出，在所选的范围内存在极值，该极值点既是响应面的最高点，也是等高线最小椭圆的中心点.这说明，本文实验因素所选择的水平区间是合理的.

图2 三乙醇胺和甘油相互影响的响应面分析图(a)及等高线分析图(b)

图3 棕榈酸异辛酯和甘油相互影响的响应面分析图(a)及等高线分析图(b)

图4 棕榈酸异辛酯和三乙醇胺相互影响的响应面分析图(a)及等高线分析图(b)

3.3 保湿霜的保湿效果

保湿霜保湿效果的测定结果如图5所示.由图5可以看出：A组在180 min内皮肤角质层的水分含量无显著变化.B组在30 min内时皮肤角质层的水分含量最高，其原因可能是基质中的成分阻断了水分的流失；在30～90 min时，可能由于基质内的水分散失，水分含量降低；在90 min后无明显变化.C组在30 min内时皮肤角质层的水分含量迅速升高；在60～90 min时水分含量平缓上升，且在90 min时水分含量最高；在90 min后随时间的推移水分含量持续降低.D组在30～60 min时，皮肤角质层的水分含量快速提高；在60～180 min时，水分含量增加缓慢.E组在0～90 min时，皮肤角质层的水分含量有显著提高，且在90 min达到最高值；在90～180 min时，水分含量高于同时间内的C组和D组，有统计学差异(P<0.05).这说明，林蛙皮极细粉和银耳粗多糖提取液在保湿效果上有协同增效作用.

图5 林蛙皮银耳保湿霜在180 min内对皮肤角质层水分含量的影响

4 结论

本文研究了棕榈酸异辛酯、三乙醇胺、甘油等物质的添加量对林蛙皮银耳保湿霜综合评分的影响，并通过单因素实验、Box-Behnken中心组合设计原理和响应面分析法等确定了保湿霜的最佳基质组成及各因素的主效应关系.实验结果表明，林蛙皮银耳保湿霜的最佳配方为：单硬脂酸甘油酯3%、棕榈酸异辛酯4%、三乙醇胺0.8%、甘油8%、林蛙皮极细粉1.5%、银耳粗多糖提取液2%，最佳配方的综合评分为9.19.本文提出的保湿霜的制备方法简单，条件温和，且保湿霜具有良好的耐寒、耐热性及稳定性和舒适性，符合化妆品GB/T 29665—2013的要求，因此该保湿霜可作为一种良好的护肤品进行开发利用.