牡丹皮不同采收期质量综合评价研究＊

张洪坤，路 丽，黄玉瑶，莫毛燕，王其丰，郭长达，梁伟龙

(1.亳州市沪谯药业有限公司 亳州 236800；2.广州市香雪制药股份有限公司 广州 510663)

牡丹的药用价值自先秦开始体现，明确记载“牡丹”始见于《神农本草经》，列为中品[1]，之后更多古书典籍[2-6]中提及牡丹的药用，入药部位为牡丹的根皮。《中国药典》（2015版）一部载，牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，秋季采挖根部，除去细根和泥沙，剥取根皮，晒干或刮去粗皮，除去木心，晒干。前者习称连丹皮，后者习称刮丹皮。苦、辛，微寒。归心、肝、肾经。具有清热凉血，活血化瘀的功效。用于热入营血，温毒发斑，吐血衄血，夜热早凉，无汗骨蒸，经闭痛经，跌扑伤痛，痈肿疮毒[7]。

牡丹皮主产安徽、四川、甘肃、陕西、湖北、湖南、山东、贵州等地，以铜陵、南陵产的凤丹皮奉为道地药材，在海内外享有盛誉，但目前市场上流通量最大、最常用的主流销售品种是亳州丹皮，而亳州谯城区所产丹皮销量较大，占亳州市场交易量的80%-90%，占全国产量的37%左右[8]。根及根茎类药材一般多在秋季地上部分将枯萎时，以及早春发芽前或者刚萌发新苗时采挖，此时根及根茎内贮藏的营养物质最丰富，一般说来，此时的有效成分的含量也相对较高[9]。牡丹皮的主要药效成分和代表活性物质包括没食子酸、儿茶素、氧化芍药苷、丹皮酚、芍药苷、苯甲酰芍药苷等[10]，2015版《中国药典》仅以丹皮酚作为指标性成分来控制牡丹皮药材及饮片的质量，单一的化学成分含量高低不能全面反映药材的内在质量，亦难以实现对中药质量的控制。本次实验通过考察牡丹植株的生长情况、物质积累情况，结合浸出物、多成分多指标含量，并采用灰色关联度法多方面综合评价不同采收期的牡丹皮质量情况，以确定牡丹皮的最佳采收期，较以往单一成分控制，更具科学依据。

1 材料、仪器与试药

1.1 样品

药材来自亳州市谯城区魏岗镇高楼村牡丹皮种植基地，经广州市香雪制药股份有限公司连林生高级工程师鉴定为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮。

不同采收月份样品：6年生牡丹植株，2017年3月至2017年12月定期采挖，每月按照梅花点法取样，分别于固定地块每个点取样6株，共30株，取样点分布（图1）。

不同生长年限样品：2017年10月采挖，包括1年-7年生牡丹植株，每生长年限样品各30株。

每月采收的样品需将样品抖净泥土，测定鲜根重。鲜根用竹刀或碗片刮去外表栓皮，抽去木心，经晒干或低温烘至水分合格，称干重，去木心的皮层用于各指标成分含量测定，每月的样品经处理后当月测定各指标含量。

1.2 仪器

RHP-250型高速多功能粉碎机（浙江永康市荣浩工贸有限公司），XS204型电子天平（d=0.1 mg，Mettler Toledo），MS603型电子天平（d=0.01 mg，Mettler Toledo），DHG-9245A型电热鼓风干燥箱（上海市一恒科学仪器有限公司），HWS-28型电热恒温水浴锅（上海市一恒科学仪器有限公司），KQ-500DA型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱仪（DAD检测器）。

1.3 试药

没食子酸（110831-201204，中国食品药品检定研究院，含量以89.9%计）、儿茶素（110877-201604，中国食品药品检定研究院，含量以99.2%计）、氧化芍药苷（MUST-16021505，成都曼斯特有限公司，含量以99.93%计）、芍药苷（110736-201539，中国食品药品检定研究院，含量以96.4%计）、苯甲酸（100419-200301，中国食品药品检定研究院）、丹皮酚（110708-201407，中国食品药品检定研究院，含量以99.9%计）、苯甲酰芍药苷（MUST-16061803，成都曼斯特有限公司，含量以99.28%计）、甲醇（AR，20160805-2，广州化学试剂厂）、乙醇（AR，161017，西陇化工股份有限公司）、乙腈（色谱纯，Merck，批号：JA041430）、磷酸（HPLC，H1503047-500 mL，阿拉丁）、超纯水。

2 方法

2.1 浸出物

取各牡丹皮样品粗粉约2 g，精密称定，置150 mL的锥形瓶中，精密加乙醇50 mL，密塞，称定重量，静置1小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中、在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，计算样品中浸出物的含量（%）。

图1 梅花点法取样分布图

表1 色谱洗脱条件表

图2 HPLC色谱图

2.2 多成分含量测定

色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测器：DAD检测器；检测波长：230 nm，258 nm（氧化芍药苷）；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速：1 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温：30℃。在此色谱条件下，取对照品、供试品溶液适量，分别进样10 μL测定，HPLC色谱图（图2）。

表2 线性关系结果

对照品溶液制备 取没食子酸、儿茶素、氧化芍药苷、芍药苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍药苷对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，得质量浓度分别为0.5 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1的单个对照品溶液。分别精密移取上述各对照品溶液适量，加50%甲醇稀释，得质量溶度分别为 0.0036 mg·mL-1、0.0030 mg·mL-1、0.0126 mg·mL-1、0.0194 mg·mL-1、0.0020 mg·mL-1、0.0501 mg·mL-1、0.0051 mg·mL-1的混合对照品溶液。

供试品溶液制备 取本品3号筛粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，回流提取1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.1 线性关系考察

将混合对照品溶液分别进样3、5、7、10、15 μl检测，以进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，进行回归分析，绘制标准曲线，得各成分的回归方程。结果见表2。

2.2.2 精密度试验

取同一混合对照品溶液，分别在同一天连续进样6次进行日内精密度试验，计算各成分峰面积的RSD，考察仪器的日内精密度。结果显示，各成分峰面积的RSD＜2.0%，说明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性试验

取同一批药材，制备供试品溶液6份进样分析，测定各成分峰面积，计算含量，考察实验方法的重复性。结果显示，各成分含量的RSD均＜3.0%，说明方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h进样检测，测定各成分峰面积，计算含量，考察样品溶液的稳定性。结果显示，各成分含量RSD均＜2.0%，说明样品在24 h内稳定。

2.2.5 加样回收试验

精密称取本品粉末6份，每份0.25 g，分别精密添加没食子酸0.3048 mg、儿茶素0.1454 mg、氧化芍药苷1.133 mg、芍药苷1.9980 mg、苯甲酸0.1400 mg、丹皮酚5.594 mg、苯甲酰芍药苷0.4711 mg，计算加样回收率。结果见（表3）。

3 结果与分析

3.1 不同采收月份牡丹皮物质积累动态

对不同生长期的牡丹皮测定生长量，结合每亩种植牡丹皮约3000～5000株，以4000株计算牡丹皮的产量，亩产量（kg）=30株药材干重*4000/30（表4）。

从表4可以看出，9月-10月，牡丹根部干物质积累量达到最高峰，平均为4.587 kg·30株-1，说明在这期间牡丹皮的亩产量较大。5月-6月，虽然牡丹皮的产量也较高，但此期正值牡丹皮生长与生殖最旺盛期，光合作用强，且春夏季节多雨，药材不易干燥，不适宜采挖；而在8-10月期间牡丹的地上部分刚枯萎，光合作用能力随时间延迟而逐渐下降，干物质积累较多，此时牡丹皮的折干率较高，亩产量较大且采挖的牡丹皮根条饱满，质地坚实，粉性足。因此，从经济效益和产量综合考虑，牡丹皮采收期应在8-10月。

表3 加样回收率试验结果

表4 不同采收月份牡丹皮物质的积累情况（kg·30株-1）

表5 牡丹皮不同采收月份各项指标成分结果（n=3）

3.2 不同采收月份牡丹皮各项指标成分测定

取牡丹皮样品，分别测定各项指标成分(表5，图3，图4)。

牡丹皮7成分含量总和以5月、8月份为最高，8月-9月下旬期间含量呈小幅度下降，相对比较稳定，之后至12月份各成分含量下降明显（图3）；浸出物含量在3月-6月期间，随月份的增加浸出物含量下降幅度较大（图4）。6月-10月期间，浸出物含量变化幅度较小，基本保持稳定，11月份含量开始回升。结合产量、有效成分分析，牡丹皮采收应选择在8-10月份。

3.3 不同生长年限牡丹皮物质积累动态（表6，表7）

2年生牡丹皮的干物质增加较快，较1年生牡丹皮干重增加了138.6%，4年生、5年生、6年牡丹皮干重比前一年的增加率均在10%以上，7年生牡丹皮干重比前一年的增加率仅为0.4%，与6年比较亩产量增加不多。1-2年生牡丹植株矮小，根少、细，不宜采收药材；3年生牡丹主根可加工成药材，但质量明显较次；4年生牡丹质量虽好，但产量相对不高，经济效益较差；5-6年生牡丹皮加工药材质量较好，在药材表面和纵裂缝处肉眼可见丹皮酚结晶，且产量较高，但7年生牡丹皮药材粉性开始降低，容易受到病虫的侵害而腐烂，肉眼可见药材表面的黑色凹状不规则疤痕，药材质量较差，且随着生长年限的延长，药材的木心率也增大。

3.4 不同生长年限牡丹皮各项指标成分测定

取不同年限牡丹皮样品，分别测定各项指标成分(表8，图5，6)。

由图5可以看出，栽后生长5年-6年期间的牡丹皮中各成分含量呈积累趋势，其中以6年生牡丹皮中各成分含量总和最高（图5）；浸出物以栽后生长5年-6年期间的牡丹皮中浸出物含量较高（图6）。综合产量、有效成分分析，牡丹皮的适宜采收期应在移栽5-6年采收。

图3 不同采收月份的牡丹皮7成分含量累积

图4 不同采收月份的牡丹皮浸出物

表6 不同生长年限牡丹皮比较

表7 不同生长年限牡丹植株生长情况（kg·30株-1）

3.5 灰色关联度分析

3.5.1 样品数据集建立

本文以不同月份和不同年限的7种成分为指标性成分，建立牡丹皮质量灰色模式识别数据集（表5，表8）。

3.5.2 原始数据规格化处理

设有n个研究样品，每个样品有m项评价指标，则组成评价单元序列，记为{Xik}(i=1,2,3,…,n;k=1,2,3,…,m;本研究中n=8,m=8)。由于评价指标之间存在测试单位不统一的问题，需对其进行变换处理。以均值化变换最为常用，见公式（1）。各指标的原始数据经规格化处理后可用于关联度计算，结果见表9。

式中Yik为规格化处理后数据，Xik为原始数据，Xk为第n个药材样品的第k个指标的均值。

3.5.3 关联度计算

用灰色关联度作为评价测度时，应选择参考序列，一般应确定最优参考序列和最差参考序列。将最优参考序列的各项指标对应n个样品对应指标的最大值，记为{Xsk}=max(1≤i≤n){Xik}，最差参考序列的各项指标对应n个样品对应指标的最小值，记为{Xtk}=min(1≤i≤n){Xik}。分别按公式（2）和公式（3）计算相对于最优参考序列和最差参考序列的关联系数。按公式（4）和公式（5）计算各评价单元相对于最优（差）参考序列的关联度；按公式（6）计算各样品的相对关联度，并按ri大小排序（表10）。

表8 不同年份牡丹皮考察结果（n=3）

图5 不同生长年限的牡丹皮7成分含量累积

最优参考序列，关联系数：

式 中 ，Δmin=min|Yik—Ysk|,Δmax=max|Yik—Ysk|(i=1,2,3,…n,k=1,2,3,…m)

最差参考序列，关联系数：

式中，Δ′min=min|Yik—Ytk|，Δ′max=max|Yik—Ytk|,(i=1,2,3,……n，k=1,2,3,……m，ρ为分辨系数，一般取值0.5。）

图6 不同生长年限的牡丹皮浸出物

相对关联度ri越大，表明牡丹皮药材的综合质量评价越高，ri排序结果可作为药材质量高低评价的依据。由表10可知，在牡丹皮不同采收年限样品中，以相对关联度的大小排序，从大到小的顺序为：6年＞5年＞7年＞2年＞1年＞3年＞4年，分析种植5-6年采收的牡丹皮综合质量较佳。在不同月份样品中，有两个时间段分别是3-4月和8-9月的牡丹皮综合质量较好，由于3-4月正值生长期，另外结合亩产量考虑，3-4月份的亩产量较低，而8-10月份的亩产量较大，所以综合有效成分质量和亩产量考虑，亳州地区的牡丹皮最佳采收期为移栽5-6年的8-10月采收。

4 总结

传统的丹皮采收季节为农历二、八月，即初春和晚秋。本次实验结果显示，不同采收季节的牡丹皮的丹皮酚、芍药苷、没食子酸等含量存在差异。儿茶素、氧化芍药苷含量随月份变化不显著；丹皮酚、没食子酸含量含量随月份变化明显，在5月、9月达到最高峰；芍药苷、苯甲酰芍药苷含量以3月份含量最高，8-12月之间含量较稳定；苯甲酸含量随月份变化呈波动式变化，6月-10月含量相对较高。7成分含量总和其随月份的变化规律与丹皮酚含量变化规律基本一致，以5月、8月份的含量总和最高，8月-9月下旬期间含量呈小幅度下降，相对较稳定。现代研究发现，牡丹皮中所含的丹皮酚成分的累积在一年内有两个高峰（5-6月和9-10月）[11]，但5-6月正值牡丹皮生长与生殖最旺盛期，光合作用强，且春夏季节多雨，药材不易干燥，不适宜采挖。8月-10月份地上枝叶变黄，在这期间牡丹皮的枝叶已枯萎，光合作用能力随时间延迟而逐渐下降，根部的干物质积累较多，根部贮存了大量的养分，此时采收的药材形体饱满、粉性足，质量和产量均高，采收的根皮药用价值最高。因此，综合药效成分含量特别是指标性物质（丹皮酚）积累量、种植成本、土地利用率、产量与经济效益等因素考虑，亳州地区牡丹皮应在8月-10月的晴天采收，这与牡丹皮药材传统采收习惯一般以种植3-5年后在秋季采收为宜相符[12]。

表9 原始数据规格化处理

表10 牡丹皮不同采收期样品相对关联度及综合排序

关于牡丹皮的种植年限，一般4-6年不等[13-16]。本次实验结果表明：随着生长年限的延长，牡丹皮的产量会不断增加。但7年生牡丹皮药材粉性开始降低，容易受到病虫的侵害而腐烂，部分根生病死亡。而且牡丹皮的主要有效成分含量只在一定年限区间内呈累积趋势，5-6年较高，6年之后含量下降。因此，亳州牡丹皮的适宜采收年限为5-6年，以6年采收最佳。

灰色关联度分析法在中药质量评价中的应用主要是基于中药样本各指标成分定量数据，建立灰色关联度评价模型，计算评价单元序列与参考序列间的相对关联度，对评价单元进行排序，从而获得评价结果[17,18]。本文从多方面研究并采用灰色关联度分析法综合评价不同采收期的牡丹皮质量情况，为亳州产区的牡丹皮的最佳采收期提供一定的参考依据。