番石榴黄酮类提取物的保鲜应用

曹湛慧，黄 和，2，刘子聪，程嘉怡

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524088；2.广东海洋大学分析测试中心，广东湛江 524088）

番石榴（Psidium guajava L.）属于桃金娘科番石榴属，广泛种植在广东、广西、海南、江西等地区，全年可采摘[1]。黄酮是一类分布广泛、备受关注的天然多酚类物质[2]。经研究发现，黄酮类化合物具有降血糖、清除自由基、防治心脑血管疾病、保肝、抗菌等功效[3]，现广泛被应用于医疗、保鲜、食用等领域。

根据国内外研究资料显示，绝大部分都在研究番石榴叶黄酮类提取物的活性、应用等，对于番石榴果实中黄酮类物质的提取及应用研究较少，张云竹等人[4]对番石榴中总黄酮的提取工艺进行优化研究。彭财英等人[5]采用正反相硅胶、凝胶、微孔树脂柱色谱、薄层色谱等手段分离，波谱法对番石榴果实中黄酮类成分进行研究。Luximon R A等人[6]研究发现，不同品种番石榴的黄酮类物质都具有有效的抗氧化能力。目前，将番石榴黄酮进行水产品保鲜研究尚未见报道。

试验通过超声波提取番石榴果实中黄酮类物质，采用聚酰胺柱层析柱对黄酮类粗提物进行纯化，将粗提物及纯化物应用于虾肉糜、鱼肉糜的保鲜研究中，以期为番石榴黄酮在水产品的保鲜应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

番石榴、新鲜的对虾、罗非鱼，购于湛江沃尔玛超市，产地湛江。

芦丁，标准品，中国食品药品检定研究所提供；聚酰胺粉、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、95%乙醇等，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1901型紫外可见分光光度计，广州市深华生物技术有限公司产品；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品；LSB50L型立式压力蒸汽灭菌锅，巩义市予华仪器有限责任公司产品；SPX-250B-Z型生化培养箱，上海高致精密仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 番石榴黄酮类物质提取工艺流程

番石榴→清洗、削皮、打浆→超声波辅助提取（料液比1∶25，乙醇体积分数60%，超声功率350 W，提取时间30 min）→过滤、离心（8 000 r/min，10 min）、浓缩→黄酮粗提物→装柱、纯化→黄酮纯化物。

1.3.2 黄酮类物质含量的测定

采用NaNO2-Al（NO3）3比色法，番石榴黄酮的提取参照文献[7-8]。

1.3.3 层析柱制备

层析柱材料的预处理：用95%的乙醇溶液浸泡聚酰胺粉和棉花24 h，使用前不断搅拌，直至没有气泡冒出。将少许棉花制成层析柱内径大小、厚度适中的薄层圈，用浸泡液使其平铺在层析柱底部，再沿着玻璃棒将预处理的聚酰胺粉加入到层析柱里至容积的2/3，轻敲柱子使聚酰胺粉间无气泡，用3倍柱体积的95%乙醇溶液洗涤，直至洗出液澄清并在蒸干后无任何残留为止，再用3倍柱体积的5%氢氧化钠、1倍柱体积的蒸馏水和3倍柱体积的10%醋酸洗涤，然后用蒸馏水洗涤，直至洗出液呈中性，备用[9]。

1.3.4 样品的分离纯化

（1）分离纯化流程。移适量的番石榴黄酮粗提物置于层析柱中，待样液完全加入到层析柱后，加少量蒸馏水至洗出液澄清，最后用体积分数70%乙醇洗涤[10]。用活塞控制洗脱速度为每滴间隔5 s，每20 mL收集 1次。将洗脱起点与终点间所收集的洗脱液合并，并置于旋转蒸发仪中进行浓缩，至与进样体积相同，于4℃下保存，备用。

（2）洗脱起点与终点的判断方法。洗脱起点与终点的判断：从不同的收集杯中吸取1 mL收集液于小试管中，用胶头滴管移入3～4滴1%的三氯化铁，充分摇匀[11]。若反应液呈绿色，则表明洗出液中含有目标化合物；若溶液呈黄棕色，则不含目标化合物。

1.3.5 番石榴黄酮类提取物的保鲜应用

（1）样品的制备。对虾去壳、冲洗干净后绞碎，制成虾糜，备用。

罗非鱼去鳞、去头、去尾、去内脏后，反复冲洗干净后绞碎，制成鱼糜，备用。

空白对照组（CK）：称取每份250 g的虾肉糜和鱼肉糜分别置于烧杯中，移入10 mL蒸馏水并充分均质，立即用保鲜膜密封，于4℃下冷藏保存，备用。

试验组：准确称取3份250 g的虾肉糜和3份250 g的鱼肉糜分别置于不同的烧杯中，每份虾肉糜和鱼肉糜分别加入10 mL预先配制的质量分数为0.5%的番石榴黄酮粗提物、0.5%的番石榴黄酮纯化物、0.15%的山梨酸钾溶液，并充分均质，迅速用保鲜膜密封，于4℃下冷藏保存，备用。

（2）感官评价。虾肉糜的感官评价方法借鉴水产品行业中《冻虾仁》的标准，而鱼肉糜借鉴陈晓眠等人[12]《壳聚糖和茶多酚对罗非鱼冷藏保鲜效果比较》的方法。随机挑选5人组成固定的评分小组，每2 d分别对每组虾肉糜、鱼肉糜的感官进行评分。评定标准分5个等级。每个人在单独情况下根据外观、肉质和气味对应的分值独立给出各项评价分值[13]。

虾肉糜感官评价标准见表1，鱼肉糜感官评价标准见表2。

表1 虾肉糜感官评价标准

表2 鱼肉糜感官评价标准

（3）pH值的测定。采用酸度计法，从空白对照组和试验组中称取虾肉糜、鱼肉糜各10 g，分别移入100 mL蒸馏水，使其均质1 min，放置30 min后进行测定[14]。每个样品平行测定2次，每隔2 d测定1次。

（4）挥发性盐基氮（TVB-N）值的测定。参照水产标准SC/T 3032—2007《水产品挥发性盐基氮的测定》[15]的方法。

（5）菌落总数的测定。参照GB 4789.2—2010《食品微生物学检验菌落总数测定》[16]执行。

2 结果与分析

2.1 黄酮类粗提物定性检测

硝酸铝反应：将样品提取液中加入2%硝酸铝溶液，样品液显示为黄色；盐酸镁粉反应：将样品提取液中加入少量镁粉，再加2滴盐酸，样品液显示为橙红色；三氯化铁反应：将样品提取液中加入数滴1%三氯化铁溶液，样品液显示为灰绿色。这都是黄酮类化合物的特征颜色反应现象，最终确定样品溶液中含黄酮类化合物。

2.2 黄酮类粗提物和纯化物的浓度计算

称取200 g番石榴果皮浆，经过提取、浓缩，分离纯化得到各500 mL的粗提物和纯化物。利用芦丁标准曲线计算样品中总黄酮含量。测得黄酮类粗提物和纯化物的质量浓度分别为0.442，0.540 mg/mL。

2.3 番石榴中黄酮类物质的保鲜应用

2.3.1 感官评分的变化

食品感官评分是通过对食品的色泽、质地、气味等进行评价打分。感官指标分值是评价食品最方便直观、简单准确的指标[17]。

虾肉糜在4℃条件下的感官评分变化见图1，鱼肉糜在4℃条件下的感官评分变化见图2。

图1 虾肉糜在4℃条件下的感官评分变化

从图1和图2可以看出，虾肉糜、鱼肉糜的品质随着贮藏时间的延长，感官评分都呈下降的趋势。对于虾肉糜，前2 d空白对照组和试验组的感官评价值没有明显的区别；从4 d起，空白对照组的虾肉糜颜色渐渐变黄，有黑点，表面出现黏液且有腐败气味，而试验组的虾肉糜感官品质的下降相对缓慢。对于鱼肉糜，前4 d每个组的感官评分差异较小；而从6 d起，相比空白对照组，纯化物、粗提物处理过的鱼肉糜，与山梨酸钾一样能有效地使感官品质下降趋势减缓。这表明，黄酮粗提物、纯化物抑菌作用好。

2.3.2 pH值的变化

鲜虾、活鱼死后由于肉质中糖原发生反应而生成大量的酸性物质，致使虾肉糜、鱼肉糜的pH值下降，而随着贮藏时间的延长，虾肉糜、鱼肉糜中的含氮物质容易被腐败菌吸收利用，产生碱性物质，使虾、鱼肉糜中pH值上升[18]。

虾肉糜在4℃条件下pH值的变化见图3，鱼肉糜在4℃条件下pH值的变化见图4。

图2 鱼肉糜在4℃条件下的感官评分变化

图3 虾肉糜在4℃条件下pH值的变化

图4 鱼肉糜在4℃条件下pH值的变化

从图3和图4可以看出，在保鲜过程中，每个空白对照组和试验组的pH值变化趋势呈相同的变化规律，其中空白对照组的pH值变化趋势比试验组尤为明显，这表明黄酮类粗提物、纯化物与山梨酸钾同样具有一定的保鲜能力。在每个试验组中，用纯化物浸泡过的虾肉糜、鱼肉糜pH值变化趋势较接近山梨酸钾，并比粗提物的变化程度慢，表明黄酮纯化物更能有效地抑制微生物的生长。

2.3.3 挥发性盐基氮（TVB-N）值的变化

TVB-N是水产品在贮藏过程中，肉质中蛋白质由于酶和细菌的作用而被转化成胺类等碱性含氮物[19]，TVB-N值已广泛成为评价水产品鲜度的重要方法之一。

虾肉糜在4℃条件下TVB-N值的变化见图5，鱼肉糜在4℃条件下TVB-N值的变化见图6。

图5 虾肉糜在4℃条件下TVB-N值的变化

图6 鱼肉糜在4℃条件下TVB-N值的变化

从图5和图6可以看出，整个试验过程中，TVB-N值的变化呈现出上升的趋势。对于虾肉糜，前4 d空白对照组和试验组的TVB-N值变化差异较小，接着空白对照组TVB-N值的递增趋势明显，而对于鱼肉糜；从6 d起，与各个试验组相比，空白对照组TVB-N值的变化趋势非常明显，说明相同保鲜条件下，鱼肉糜比虾肉糜有更长的保鲜期。在各个试验组中，粗提物、纯化物和山梨酸钾的TVB-N值上升趋势较为缓慢，且在贮藏期的6 d，用粗提物、纯化物和山梨酸钾处理过的虾肉糜与鱼肉糜TVB-N值分别是27.49，23.21，20.24，23.50，20.39，19.93 mg/100 g，证明粗提物和纯化物具有一定的抑菌作用，纯化物抑菌效果比粗提物要好。

2.3.4 菌落总数对数值的变化

水产品的腐败变质大部分由于微生物的生长繁殖引起，其腐败程度主要取决于微生物的繁殖速度，因而菌落总数能够成为衡量水产品鲜度的一项重要指标[20]。

虾肉糜在4℃条件下菌落总数对数值的变化见图7，鱼肉糜在4℃条件下菌落总数对数值的变化见图8。

图7 虾肉糜在4℃条件下菌落总数对数值的变化

图8 鱼肉糜在4℃条件下菌落总数对数值的变化

从图7和图8可以看出，无论是虾肉糜还是鱼肉糜，空白对照组的菌落总数比每个试验组多，且上升幅度比相同保鲜期的试验组显著。对于虾肉糜，空白对照组3 d就达到1×106，用粗提物、纯化物和山梨酸钾处理过的虾糜分别是5，7，8 d达到1×106，对于鱼肉糜，空白对照组4 d达到1×106，用粗提物、纯化物和山梨酸钾处理过的虾糜分别是6，7，9 d达到1×106。这表明粗提物、纯化物具有一定的抑制微生物生长繁殖的能力，且黄酮纯化物抑菌效果优于粗提物。

3 结论

采用超声波辅助法提取番石榴果皮中黄酮类物质，经过提取、浓缩、分离纯化，得到粗提物和纯化物。通过计算黄酮类粗提物和纯化物的质量浓度分别为0.442，0.540 mg/mL。

以0.15%的山梨酸钾为阳性对照，以感官评价、pH值、挥发性盐基氮值和菌落总数为评价指标，将番石榴黄酮类粗提物和纯化物在4℃保鲜条件下保鲜虾肉糜、鱼肉糜。结果表明，0.5%番石榴黄酮类粗提物和纯化物能有效减缓虾肉糜、鱼肉糜的品质下降进程，降低挥发性盐基氮值，抑制腐败菌的增长，延长虾肉糜、鱼肉糜的保质期。番石榴黄酮类纯化物保鲜效果优于粗提物，可作为一种天然防腐剂使用。