响应面法优化霍山石斛三萜皂苷提取工艺研究

陈乃东，王 成，陈乃富，陈存武，韩邦兴，戴 军，程 浩

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.霍山县天下泽雨生物科技发展有限公司，安徽 霍山 237266)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanneseTang et Cheng)，俗称米斛，为兰科石斛属多年生草本植物[1](P75)，主产于安徽霍山等地，含有三萜皂苷、甾体皂苷及醛类等成分[2]，具有生津益胃、明目强身、抗肿瘤、抗衰老、扩张血管等功效[3-6]，是安徽道地药材之一。

现代药理学研究表明，三萜皂苷具有显著的抗炎、抗病毒、抗衰老、防治心脑血管疾病等药理活性[7]，截至目前尚无霍山石斛中三萜皂苷提取及含量测定研究的报道。有鉴于此，本研究首先采用Box-Benkhen设计优化获得霍山石斛中总三萜皂苷的提取条件，采用最佳提取工艺条件，对其根茎叶中总三萜皂苷的含量进行对比研究。研究结果可望为霍山石斛药材的综合开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验材料霍山石斛2018年11月采自霍山县天下泽雨生物科技发展有限公司太平畈石斛基地，品种经皖西学院陈乃东教授鉴定为霍山石斛(DendrobiumhuoshaneseTang et Cheng)。霍山石斛新鲜全株，洗净，-50 ℃冷冻干燥至恒重，粉碎，过40目筛，备用。

齐墩果酸标准品(纯度≥98%，批号508-02-1，aladin公司)；香草醛(分析纯，北京化学试剂公司)；冰醋酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司)；无水碳酸钠(分析纯，天津市北辰方正试剂厂)。

FA-1004型号电子天平(上海精科天平厂)；HR/T20MN型立式高速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)；TU-1901型双束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的制备

精密吸取0.1 mg/mL标准齐墩果酸甲醇溶液0.00 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL分别放入10个刻度试管中，于75 ℃水浴中挥去甲醇，加入新配制的浓度为5%的香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，摇匀；60 ℃水浴加热15 min，取出后立即用流水冷却数分钟，摇匀，加入4.0 mL乙酸乙酯稀释，以不加标准品溶液的平行样为空白，在554 nm处测定吸光值(A)[8]。以标准齐墩果酸甲醇溶液的浓度(mg/mL)为横坐标，测定的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程A= 28.309C-0.03(R2=0.9909)，结果表明齐墩果酸浓度在2～24 ug/mL范围内呈良好的线性关系。

1.2.2 总三萜皂苷的提取

精密称取0.5 g干燥至恒重的霍山石斛干粉，一定浓度的甲醇冷凝回流提取过滤获总三萜皂苷提取液。

1.2.3 总三萜皂苷含量的测定

精密吸取0.2 mL按“1.2.2”方法制备的提取液，按1.2.1所述步骤操作，在554 nm处测定吸光值(A)，代入标准曲线，计算霍山石斛中三萜皂苷的提取得率。

1.2.4 单因素试验

精密称取0.5 g干燥至恒重的霍山石斛干粉若干份，按表1的设计进行单因素实验，依次考察甲醇浓度、提取次数、提取时间、提取温度、液料比对霍山石斛三萜皂苷提取得率的影响，当考察其中一个因素时，其他因素均取表1所述的第3水平。实验设三个重复。

表1 单因素实验设计表

1.2.5 响应面法试验因素水平设计

结合单因素试验结果，选择以溶剂浓度(A)、提取次数(B)、提取时间(C)、提取温度(D)、液料比(E)作为相应变量，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，编码水平为-1，0和1，且分别以三萜皂苷提取得率(Y)作为响应值，设计5因素3水平响应面法优化提取工艺，实验因素水平编码见表2。

表2 实验因素水平编码表

1.2.6 数据分析

使用软件Design Expert 10.0对响应面法设计实验的结果进行分析，确定霍山石斛三萜皂苷的最佳提取工艺。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 甲醇浓度对霍山石斛总三萜皂苷提取得率的影响

由图1-1可知，当甲醇浓度在0%～75%变化时，三萜皂苷的提取得率逐渐增加，当甲醇浓度为75%时，三萜皂苷提取得率达到最大，之后甲醇浓度的增加，三萜提取得率反而下降，可能是因为甲醇浓度的增加，使杂质的溶出加大，阻碍的三萜皂苷的溶出，因此，实验选择甲醇浓度0%～50%作为优化提取范围。

2.1.2 提取次数对霍山石斛总三萜皂苷提取得率的影响

从图1-2可知，当提取次数在1～3次变化，三萜皂苷提取得率显著增加；当提取次数大于3次时随着提取次数增加，三萜皂苷提取得率的变化趋于平缓，继续增加提取次数的意义不大，因此，实验选择提取次数为2～4次作为优化提取范围。

2.1.3 提取时间对霍山石斛总三萜皂苷提取得率的影响

从图1-3可知，当提取时间在0.5～2 h变化，三萜皂苷提取得率增长迅速；当提取次数为2～4 h时，三萜皂苷提取得率的变化趋于平缓，提取时间较短时，提取可能不充分，因此提取得率较低，随着提取时间的增加，三萜皂苷的溶出已达限度，因此，从提高效率的角度考虑，实验选择提取时间为0.5～2 h作为优化提取范围。

2.1.4 提取温度对霍山石斛总三萜皂苷提取得率的影响

从图1-4可知 ，当提取温度在20～80 ℃变化，三萜皂苷提取得率逐渐增加 ；温度越高，提取得率越大，但80 ℃以后，随着提取温度的增加，可能会有部分三萜皂苷因高温而分解，因此，实验选择提取时间为40～80 ℃作为优化提取范围。

2.1.5 液料比对霍山石斛总三萜皂苷提取得率的影响

从图1-5可知，当液料比在10∶1～50∶1变化时，三萜皂苷提取得率逐渐增加，当液料比较小时，溶剂较少，因此，提取得率较小，随着溶剂增加，溶剂与物料接触很充分，但物料中三萜皂苷的溶出会达到上限，因此，实验选择液料比20∶1～40∶1作为最佳优化提取范围。

图1 单因素实验结果

2.2 响应面法实验结果及数据分析

2.2.1 模型建立与显著性考察

采取Design-Expert 10.0.4软件对单因素实验所得数据进行分析，表3为通过软件分析之后得到的对霍山石斛提取的五因素三水平实验设计及各实验条件下的霍山石斛总三萜皂苷提取得率。

2.2.2 响应面分析

依据表4的结果，利用Design-Expert 10.0.4进行回归分析，得到霍山石斛三萜(Y)与甲醇浓度(A)、次数(B)、时间(C)、温度(D)、液料比(E)多元非线性回归方程：

利用Design-Expert 10.0.4软件，将46个试验点的总三萜皂苷提取得率输入，得到霍山石斛总三萜皂苷提取最佳工艺条件为甲醇浓度35%，次数4次，提取时间1.5 h，温度64 ℃，液料比30∶1。

表3 响应面法优化试验设计及结果

从表4回归模型的方差分析显著性检验看，因素的一次项(A、B、C、D、E)，因素的二次交互项(CD、BE)，二次项 (A2、B2、C2、D2E2)，对三萜皂苷提取得率的影响是显著的(P<0.05)，其余一次项和二次项交互项对结果影响不显著(P>0.05)。 在本实验设计范围内，该模型的P值为0.0001；说明模型的回归极显著；模型的相关系数为0.9614，说明该模型能解释96.14%响应值的变化，即该模型与实际实验拟合良好，也证明了响应面法优化霍山石斛三萜皂苷的提取工艺是可行的。

表4 回归模型显著性检验结果

注：*p<0.05，差异显著；**p<0.01，差异极显著。

2.3 响应面优化分析图

为了更直观地表现对提取得率的影响较为显著的二次交互项CD、BE的对霍山石斛总三萜皂苷提取的影响，绘制两因素交互作用的响应面图(图2、图3)，可见，甲醇浓度(E)与时间(B)，次数(D)与温度(C)的交互作用对三萜皂苷的提取得率的影响是显著的。

图2 甲醇浓度和时间对总三萜皂苷提取得率影响的响应面

图3 次数和温度对总三萜皂苷提取得率影响的响应面

图2为其他因素在一定水平，固定时间不变时，三萜皂苷的提取得率随着甲醇浓度的增大呈现先升后降的趋势；当甲醇浓度较大时，三萜皂苷的提取得率随着时间的增加呈现先上升后平缓下降的趋势，甲醇浓度较低时，三萜皂苷的提取得率随着时间的增加快速增加，达到一定值后趋于平缓。从响应面可看出甲醇浓度的上升幅度比时间陡峭，因而甲醇浓度对三萜皂苷的提取得率影响大于时间。

图3为其他因素在一定水平，固定温度不变时，三萜皂苷的提取得率随着提取次数的增大呈现先升后降的趋势；当提取次数较少时，三萜皂苷的提取得率随着温度的增加呈现先上升后平缓下降的趋势，提取次数较多时，三萜皂苷的提取得率随着温度的增加缓慢增加，达到一定值后趋于平缓。从响应面可看出次数的上升幅度比温度陡峭，因而次数对三萜皂苷的提取得率影响大于温度。

2.4 验证实验

为了对最优提取工艺进行验证，在甲醇浓度35%，次数4次，提取时间1.5 h，温度64 ℃，液料比30∶1的条件下进行三组平行重复实验，最终得到的霍山石斛三萜皂苷的提取得率为3.04%，与预测值差异较小。因此该工艺参数可用来指导霍山石斛三萜皂苷的提取。

2.5 霍山石斛根茎叶总三萜皂苷含量测定

在最佳提取条件下提取条件下对霍山石斛的根，茎，叶分别提取，测定其总三萜皂苷的含量，最终的到三萜皂苷的提取得率分别为3.46%、0.85%、2.47%，通过测定发现霍山石斛叶中三萜含量高于根和茎，此结论对霍山石斛中甾体皂苷的工业化制备提供了理论依据。

3 结论

通过响应面优化法，对提取次数、甲醇浓度、液料比、提取时间、提取温度这五个因素进行考察，并采用Design-Expert 10.0.4软件进行分析，通过二次回归方程，得到的最优提取工艺为甲醇浓度35%，次数4次，提取时间1.5 h，温度64 ℃，液料比30∶1，在此条件下，霍山石斛三萜皂苷的提取得率为3.04%。

霍山石斛的传统用药方式以茎入药，在采收中，根和叶作为废弃物直接丢弃，本实验结果表明，霍山石斛根和叶中总三萜皂苷的含量分别为3.16%和2.47%，中明显高于茎中的0.85%，该结果可为霍山石斛资源综合利用提供参考依据。