星点设计响应面法优化吉非替尼合成工艺

潘岩

(信阳农林学院 生物与制药工程学院，河南 信阳 464000)

吉非替尼(Gefitinib)（图1），化学名4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-[3-(4-吗啉基)丙基]喹唑啉，商品名易瑞沙，由阿斯利康原研，2003年于我国上市，临床上用于治疗非小细胞肺癌[1]。EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)，上皮生长因子受体，是吉非替尼的药物作用靶点。EGFR是一种致癌基因，可能会引起肺部，脑部以及颈部的癌变[2]。吉非替尼是ATP(三磷酸腺苷)类似物，是一个高选择性的EGFR抑制剂，可与EGFR结合，抑制癌细胞生长[3]。吉非替尼作用靶点明确，不良反应较少，具有很大的医疗、市场价值。

目前文献所报道的合成路线大多存在合成路线较长、原料试剂昂贵等问题[4-6]，不利于工业化生产，急需开发出一条合成步骤少，原料易得，简单易行的合成路线。

星点设计—响应面法是近年来国际上使用的一种数学建模和实验设计方法，可应用药物合成工艺研究[7]。与传统的正交设计、均匀设计相比，响应面法更能体现出因素之间的交互作用，结果可信度高，预测出的反应条件更加接近最优反应条件[8]。

图1 吉非替尼化学结构式

专利WO9633980[10]报道的合成路线，通过甲基化反应、乙酰化反应、氯代反应、缩合反应、水解反应、烃基化反应六步制得目标产物吉非替尼，合成步骤较长。甲基化反应中使用蛋氨酸，试剂昂贵，增加了成本；乙酰化反应使用的乙酸酐为易制毒的、管控的试剂，不易得；氯代反应中使用了二氯亚砜作为氯代试剂，产生二氧化硫、氯化氢等废气，污染环境，而且氯化亚砜的毒性较大，不易操作。该路线较长，所用试剂不易得，对环境污染严重。

根据专利报道的路线（见图2），首先对合成路线进行优化，优化后的路线如下。用易制得的乙酰氯代替易制毒的乙酸酐，用环境友好的浓盐酸代替污染严重的氯化亚砜，将氨基缩合和水解两步反应合为一步，最后经过四步反应便可制得目标产物吉非替尼。接着用星点设计—响应面法对路线中的关键步骤—目标产物吉非替尼的合成一步进行优化，最终路线总产率高于文献报道产率，所用试剂廉价清洁，合成工艺绿色、环境友好，有利于工业化生产。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂和仪器

所用仪器为SGW-4B显微型熔点仪(杭州科晓化工)；质谱为Thermo TSQ Quantum LC/MS(美国Waters公司)；高效液相色谱仪Agilent1200；薄层硅胶板GF254(青岛海洋化工)。所用化学试剂和溶剂均为市售分析纯或化学纯。

1.2 6-乙酰氧基-7-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮(4)的合成

将96.0g (0.5mol) 6-羟基-7-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮、75.6g(0.75mol)三乙胺、1000mL二氯甲烷加至2000mL四颈瓶中，室温搅拌至 6-羟基-7-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮完全溶解，降温至0 ～ -5℃，在该温蒂下缓慢滴加64.3g(0.6mol)新制备的乙酰氯，40min滴加完毕，继续搅拌反应2h，加入800mL水搅拌20min淬灭反应，加入1mol/L稀盐酸调至溶液pH=7，抽滤，得滤饼，滤饼用500mL水洗涤，60℃真空干燥4h，得 6-乙酰氧基-7-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮为白色固体，得量114.7g，收率98%，m.p.300.5-301.9℃，文献值m.p.303-305℃[10]，MS m/z(%)：233[M+H]-;1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.33(s,1H,=NH),8.09-8.08(d,J=3.52Hz,1H,=CH),7.76(s,1H,ARH), 7.18(s,1H,ArH), 3.82(s,3H,-OCH3), 2.20(s,3H,-COCH3)。

1.3 6-乙酰氧基-4-氯-7-甲氧基喹唑啉(3)的合成

将117g(0.5mol) 6-乙酰氧基-7-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮、500mL 50%乙醇溶液加至2000mL四颈瓶中，缓慢加入100mL 36%浓盐酸，继续加入68g(0.5mol)氯化锌，室温搅拌24h，反应完全后，用40% KOH溶液调至溶液pH=7，加入二氯甲烷(300×3)萃取，得二氯甲烷相，减压浓缩，得棕色固体残余物，棕色固体用400mL 50%甲醇溶液重结晶，得6-乙酰氧基-4-氯-7-甲氧基喹唑啉为白色固体，得量119.7g，收率95%，m.p.155.1-154℃，文献值m.p.157-159℃[11]，MS m/z(%)：253[M+H]+;1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.84(s,1H,=CH), 7.77(s,1H,ArH), 7.40(s,1H,ArH),3.85(s,3H,-OCH3), 2.20(s,3H,-COCH3)。

1.4 4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羟基-7-甲氧基喹唑啉(2)的合成

图2 合成路线

将127g(0.5mol) 6-乙酰氧基-4-氯-7-甲氧基喹唑啉、87g(0.6mol)3-氯-4-氟苯胺、800mL无水乙醇加入到2000mL四颈瓶中，加热回流反应8h，冷却降温，降至室温后，用40%KOH溶液调节pH=12，继续室温搅拌反应16h，降温至-10℃，析出白色固体，抽滤，得滤饼，滤饼用无水乙醇洗涤，得4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羟基-7-甲氧基喹唑啉为类白色固体，得量160.6g，收率89%，m.p.283.4-286℃，文献值m.p.285-288℃[12]，MS m/z(%)：320[M+H]+;1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.38(s,1H,-NH-),8.38(s,1H,=CH),8.13-8.11(dd,1H),7.76-7.72(m,1H),7.68(s,1H),7.33-7.28(t,1H),7.12(s,1H),3.88(s,3H,-OCH3).

1.5 吉非替尼(1)的合成

将159.5g(0.5mol) 4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羟基-7-甲氧基喹唑啉、无水118.8g(0.6mol)碳酸钾、800mL无水乙醇加入到2000mL四颈瓶中，室温下滴加97.8g(0.6mol)3-氯丙基吗啉，1h内滴加完毕，加热回流搅拌反应6h，降至室温，抽滤，弃滤饼，减压浓缩滤液，得棕色固体，用500mL水洗涤，抽滤，得滤饼，50℃减压干燥，得粗品为类白色固体，得量180.3g，收率78.3%。继续用50%异丙醇溶液重结晶，0.5g活性炭脱色，得精品吉非替尼为白色固体，得量170.7g，收率94.6%。HPLC检测其纯度为99.9%，m.p.190.1-190.9℃，文献值m.p.190.2-191.5℃[13]，MS m/z(%)：447[M+H]+；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.49(s,1H,-NH-),δ8.49(s,1H,=CH),8.13-8.10(dd,1H),7.82-7.78(m,1H),7.75(s,1H),7.43-7.41(t,1H),7.16(s,1H),4.16-4.13(t,2H,CH2-O-),3.93(s,3H,-OCH3),3.59-3.57(t,4H),2.48-2.45(t,2H),2.38(m,4H),2.00-1.96(t,2H).

2 工艺优化

2.1 星点设计

使用星点设计—响应面法对目标化合物1吉非替尼的反应条件进行优化。首先根据单因素实验结果，影响目标化合物1产率的因素为：4-(3-氯-4-氟苯胺基)-6-羟基-7-甲氧基喹唑啉和3-氯丙基吗啉的投料比(下文简称为摩尔比)、无水碳酸钾的用量、反应温度。再使用Design-Expert.V8.0.6进行星点设计，响应值是目标化合物1吉非替尼的收率，最后利用该软件的Ponit Prediction功能预测最佳反应条件。

表1 星点设计因素水平表

实验表中用编码值(±ɑ、±1、0)代表水平值。

根据表2中的实验结果进行多元线性回归和二项式拟合，得到目标化合物1吉非替尼的最终统计学模拟等式为：

yield = -0.95762＋0.45253×A＋0.79863×B＋0.017927×C-5.0×10-4AB＋8.02083×10-4AC-2.26042×10-3BC-0.13727A2-0.21576B2-1.00090×10-4

对该等式进行统计学方差分析，结果如下：

总模型的F值为30.25表明该模型可信。A、B、C、AB、AC、BC的P值都＜0.05表明模型可信度高。

2.2 响应面分析

对所得数据进行响应面分析，结果如下：

图1a～3a，当A、B、C取值较小时，响应面较陡，说明A、B、C取值较小时对产率的影响较大。图1b，等高线呈椭圆形，说明当温度一定时，摩尔比和碱用量交互作用显著，且当反应温度一定时，在合适的摩尔比和碱用量条件下，产率会出现极大值。图2b，等高线呈椭圆形，说明当摩尔比一定时，反应温度和碱用量交互作用显著，增大碱用量和反应温度，产率会出现极大值。图3b，等高线呈椭圆形，说明当碱用量一定时，反应温度和摩尔比交互作用显著，在合适的反应温度和摩尔比条件下，产率会出现极大值[14-15]。

表2 星点设计实验方案表

表3 响应面方差分析结果

综合以上分析结果，使用软件Design-Expert.V8.0.6的Ponit Prediction功能，预测出响应值最大的反应条件为：摩尔比1.44:1，碱用量1.87:1，反应温度78℃，预测收率为76.2%。

2.3 结果验证

按照预测的最优反应条件，摩尔比1.44:1，碱用量1.87:1，反应温度78℃，设计三组平行实验，对预测收率进行验证，得平均收率为78.4%，与预测结果相近，说明星点设计—响应面法可用于吉非替尼合成工艺的优化。

3 结果和讨论

(1)该路线总收率61.4%。

图1 摩尔比和碱用量对产率的响应值(a)和等高线(b)的影响

图2 碱用量和反应温度对产率的响应值(a)和等高线(b)的影响

图3 摩尔比和反应温度对产率的响应值(a)和等高线(b)的影响

(2)制备中间体4时，用易得的乙酰氯代替易制毒的乙酸酐，且乙酰氯作为乙酰化试剂时，该步产率更高。

(3)制备中间体3时，用清洁的浓盐酸代替氯化亚砜作为氯代试剂，减少了氯化亚砜产生的氯化氢、二氧化硫等废气排放，环境友好。

(4)由中间体3可直接制得中间体2，缩短了反应步骤，提高了路线的总产率。

(5)目标化合物1—吉非替尼的合成中，用星点设计—响应面法进行实验设计和结果分析，有效减少了工艺研究中的实验次数，优化后的反应条件为：摩尔比1.44:1，碱用量1.87:1，反应温度78℃，响应面法分析结果可信度高，预测值接近真实值，表明星点设计—响应面法可用于药物合成工艺研究。