c-myc抑制剂10058-F4对Ph+ALL细胞凋亡的影响及相关机制研究

侯宇,廖芬芳,刘漫宇,王伟章

(广东药科大学生命科学与生物制药学院/广东省生物活性药物研究重点实验室,广东 广州 510006)

费城染色体阳性(philadelphia chromosome positive,Ph+)急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是最致命的白血病,约占成年人ALL患者的20%以及老年ALL患者的50%[1]。尽管酪氨酸激酶抑制剂改善了这一恶性疾病的预后,但仍然不能彻底治愈该疾病。因此,探索新的Ph+ALL治疗方法仍然十分必要。原癌基因c-myc在细胞增殖、凋亡和分化过程中起着重要的调控作用,其异常表达在包括ALL在内的多种人类肿瘤中屡见不鲜[2]。c-myc蛋白也因此成为了许多肿瘤包括淋巴瘤和白血病治疗的潜在药物靶点[3]。然而,迄今为止c-myc小分子抑制剂抗Ph+ALL的研究却鲜有报道。因此,本研究拟采用c-myc的小分子抑制剂10058-F4作用于Ph+ALL细胞株Sup-B15和原代Ph+和Ph-ALL细胞,通过流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,以及Western bloting检测c-myc及其下游调控基因蛋白的表达,初步探讨10058-F4抗Ph+ALL的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养 Sup-B15细胞购自中国科学院上海分院细胞库。细胞培养于含20%(φ)胎牛血清(美国Gibco公司)的IMDM培养液(美国Gibco公司))中,置于5%(φ)CO2的37 ℃培养箱。ALL患者骨髓样品经淋巴细胞分离液分离获取白细胞,细胞培养于含20%胎牛血清的IMDM培养液中。

1.1.2 一般资料 ALL患者的骨髓样品收集于广东药科大学附属第一医院,均确诊为Ph+和Ph-初发患者,且未接受放、化疗,2名患者均为女性。

1.1.3 主要仪器 FACScalibur型流式细胞仪(美国BD公司) 。

1.1.4 主要试剂 格列卫(imatinib mesylate,IM)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)购自美国Sigma公司；PPP和10058-F4购自selleck公司；c-myc、Mcl-1、Bcl-2和Bcl-xl购自美国abcam公司；Bcl-abl、GAPDH、Bcr-abl、p-crkl、辣根过氧化物酶标山羊抗兔和羊抗小鼠IgG抗体购自美国CST公司；Bax抗体购自武汉博士德公司；凋亡试剂盒购自美国Biolegend公司；ECL购自美国Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞周期检测 以终浓度为20、40和60 μmol/L的10058-F4和5.0 μmol/L的IM处理Sup-B15细胞不同时间(6、12、24 h) 后,收集细胞,1×PBS润洗细胞2次,-20 ℃预冷70%(φ)乙醇固定过夜。上机前样品用1×PBS润洗2次,1×PBS 100 μL重悬细胞并加入RNA酶2 μL,于37 ℃条件下孵育15 min,再以1×PBS润洗,1×PBS 100 μL重悬细胞,加入PI 5 μL,室温避光孵育5 min,最后加入1×PBS至500 μL体积,混匀后上机检测。

1.2.2 细胞凋亡检测 以终浓度为20、40和60 μmol/L的10058-F4处理Sup-B15细胞48 h和72 h。原代ALL细胞经40 μmol/L的10058-F4处理72 h。处理完成后收集细胞,冰育PBS润洗2次,离心去上清,加入1×binding buffer 100 μL 重悬,再加入Alexa Flour 647 Annexin-V 试剂4 μL,混匀,室温避光孵育10 min。再加入PI 7 μL,最后加入1×binding buffer 200 μL调整细胞数为每毫升1×106,上机检测。

1.2.3 Western blotting分析 不同浓度的PPP(0.5、1.0和5.0 μmol/L)、10058-F4(20和40 μmol/L)和5.0 μmol/L的IM处理细胞24 h后,收集细胞并提取蛋白。样品经SDS-PAGE电泳分离,冰上湿转1.5 h至PVDF膜,室温条件下5%脱脂奶粉封闭2 h,加入含5% BSA稀释液稀释的c-myc、Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-abl、GAPDH、Bcr-abl和p-crkl抗体(1∶1 000),4 ℃过夜,加入稀释的相应二抗 (1∶5 000),室温孵育1 h。洗膜后用ECL solution显色,最后进行显影,定影。

2 结果

2.1 c-myc抑制剂10058-F4对Sup-B15细胞凋亡的影响

20、40和60 μmol/L的10058-F4处理Sup-B15细胞48 h和72 h后,20 μmol/L的10058-F4对细胞凋亡无明显影响,而40、60 μmol/L的10058-F4均显著地诱导Sup-B15细胞发生凋亡(图1)。

2.2 c-myc抑制剂10058-F4对Sup-B15细胞周期的影响

不同浓度的10058-F4以及5 μmol/L的IM处理细胞6、12、24 h后对细胞周期均无明显影响(图2)。

2.3 c-myc抑制剂10058-F4对c-myc及其下游调控基因蛋白表达的影响

20、40 μmol/L的10058-F4处理细胞24 h后,20 μmol/L的10058-F4对c-myc、Bcl-2、Bax、Bcl-abl和p-crkl蛋白表达均无明显影响,而对Bcl-xl和Mcl-1的蛋白表达具有明显的抑制作用(图3)。40 μmol/L的10058-F4对Bcl-2、Bax和p-crkl蛋白表达均无明显影响,而对c-myc、Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1和Bcl-abl具有明显的抑制作用。作为阳性对照,不同浓度的PPP(0.5、1.0、5.0 μmol/L)均显著抑制c-myc、Bcl-2、Mcl-1和p-crkl蛋白的表达,而对Bcl-xl、Bax和Bcr-abl的蛋白表达无明显影响。5 μmol/L的IM显著抑制c-myc、Mcl-1和p-crkl蛋白的表达,对Bcl-xl、Bcl-2、Bax和Bcr-abl的蛋白表达无明显影响。

1. DMSO； 2.10058-F4 20 μmol/L； 3. 10058-F4 40 μmol/L； 4. 10058-F4 60 μmol/L。与溶剂对照组(DMSO)比较：*P<0.05,**P<0.01。

图1流式细胞术检测10058-F4对细胞凋亡的影响

Figure1Effect of 10058-F4 on cell apoptosis by flow cytometry

1. DMSO； 2. 10058-F4 20 μmol/L； 3. 10058-F4 40 μmol/L； 4. 10058-F4 60 μmol/L； 5. IM 5 μmol/L。

图2流式细胞术检测10058-F4和IM对细胞周期的影响

Figure2Effect of 10058-F4 and IM on cell cycle distribution by flow cytometry

1. DMSO； 2. PPP 0.5 μmol/L； 3. PPP 1.0 μmol/L； 4. PPP 5 μmol/L； 5. 10058-F4 20 μmol/L； 6. 10058-F4 40 μmol/L； 7. IM 5 μmol/L。

图3Western blotting检测PPP、10058-F4和IM对c-myc、Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bax、Bcl-abl和p-crkl蛋白表达的影响

Figure3Effect of PPP,10058-F4 and IM on protein expression of c-myc,Bcl-2,Bcl-xl,Mcl-1,Bax,Bcl-abl andp-crkl by western blotting

2.4 10058-F4对Ph+和Ph-的原代ALL细胞死亡的影响

40 μmol/L的10058-F4处理Ph+和Ph-的原代ALL细胞72 h后,Ph+的原代ALL细胞凋亡率(AV+)显著提高,而细胞坏死率(PI+)无明显变化；Ph-的原代ALL细胞坏死率(PI+)显著提高,而细胞凋亡率(AV+)无明显变化(图4)。

与溶剂对照组(DMSO)比较：**P<0.01。

图4流式细胞术检测10058-F4对细胞死亡的影响
Figure4Effect of 10058-F4 on cell death by flow cytometry

3 讨论

以往的研究已经发现,c-myc的高表达在白血病发生过程中起关键的作用[4],抑制c-myc能够阻止白血病的发生[5]。同时,越来越多的证据也显示,c-myc抑制剂在多种肿瘤中均显示出很强的抗癌活性。本研究发现,c-myc抑制剂10058-F4在诱导Ph+急性淋巴细胞白血病细胞凋亡同样非常有效,提示10058-F4具有治疗 Ph+ALL的潜能。

10058-F4是一种通过阻断c-myc和MAX的二聚化而抑制c-myc反式激活活性的c-myc抑制剂。研究发现,在不同的肿瘤类型中它可以通过诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡和细胞分化等多种途径发挥抗癌作用。在AML细胞中,10058-F4通过抑制c-myc蛋白表达,上调CDK抑制蛋白p21和p27使AML细胞停滞在G0/G1期。同时,10058-F4通过下调Bcl-2蛋白的表达以及上调Bax蛋白的表达激活线粒体途径诱导细胞凋亡。此外,10058-F4也通过激活多种转录因子诱导AML骨髓细胞分化[6]。而在肾癌细胞中,10058-F4明显降低线粒体氧化磷酸化蛋白(NDUFS1、SDHA、UQCRC2、COXIV、OSCP)的表达,引起线粒体活性氧(ROS)产生明显增高,从而诱导细胞凋亡[7]。10058-F4除了自身具有抗肿瘤活性外,还能够增强肝癌细胞[8]和胰腺导管腺癌[9]对常规化疗药物的敏感性,以及逆转CML细胞对伊马替尼的耐药性[10]。这些研究成果表明,10058-F4具有较为广泛的抗肿瘤活性。以往的研究已经提示,c-myc是Ph+ALL潜在的治疗靶点[11]。因此,本研究通过10058-F4进一步研究c-myc在Ph+ALL细胞中的作用及其机制。本研究发现,低浓度10058-F4(20 μmol/L)对Sup-B15细胞凋亡无明显影响,同时对c-myc、Bcl-2和Bcl-xl亦无抑制作用,但能够抑制Mcl-1蛋白的表达；而高浓度10058-F4(40 和60 μmol/L)显著地诱导Sup-B15细胞凋亡,同时也明显地抑制c-myc、Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1的蛋白表达,提示10058-F4促进Sup-B15细胞的凋亡与抑制c-myc调控的抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl的表达相关,而与Mcl-1的表达抑制无关。此外,本研究也发现,与Bcr-abl靶向药物IM相比,10058-F4能够抑制Bcr-abl蛋白的表达,但对其下游靶蛋白crkl的磷酸化无影响,这与IM的作用机制明显不同。鉴于Bcr-abl对于Ph+细胞生存的关键作用,抑制Bcr-abl蛋白的表达可能是10058-F4发挥抗Ph+ALL作用的一种全新的分子机制,但其抑制Bcr-abl表达的分子调控机制仍有待深入的研究。

综上所述,本研究初步探讨了10058-F4抗Ph+ALL的作用及其相关的分子机制,为将10058-F4开发成为治疗Ph+ALL药物提供理论依据。