复方赤灵芝营养粉对小鼠抗疲劳作用和氧化损伤模型小鼠的影响

林伟龙，李兆安，蔡金艳

(1.广东药科大学药学院，广东 广州 510006； 2.爽乐健康科技(中国)有限公司，广东 广州 510006)

灵芝种类繁多，其中药用价值最高是紫灵芝，赤灵芝次之。现代分析研究显示灵芝中主要活性成分有多糖类、生物碱、氨基酸、三萜类化合物以及微量元素等[1-2]。灵芝在我国应用历史悠久，近年来研究发现灵芝能延缓疲劳，抗氧化功效显著[3]。本研究以赤灵芝为主要原料并与具有滋补功能的药材打粉混合制成的营养粉为研究对象，通过运动实验以及氧化损伤模型来考察该营养粉的抗疲劳、抗氧化功效，为进一步深入开发赤灵芝保健产品提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SPF级昆明小鼠80只，体质量15～18 g，购自广东省实验动物中心，生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002。

1.2 药物及试剂

复方赤芝营养粉由爽乐健康科技(中国)有限公司提供，每100 g中含有：赤芝50 g，菟丝子2 g，枸杞子2 g，五味子2 g，黄精2 g，桑葚2 g，油菜花粉20 g及羊奶粉20 g，产品的化学及微生物测试结果均符合食品安全国家标准；生理盐水(上海信裕生物科技有限公司)；溴代苯油、肝素钠(上海麦克林生化科技有限公司)；MDA含量试剂盒(批号：20170725)、GSH-Px活性试剂盒(批号：20170725)、SOD活性试剂盒(批号：20170725)、BCA蛋白含量试剂盒(批号：20170725)，南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器

全波长扫描酶标仪(Multiskan GO，美国赛默飞世尔公司)；JXFSTPRP-32匀浆仪(上海净信实业发展有限公司)；H1650R离心机(湖南湘仪仪器有限公司)；Secura213电子天平(北京赛利多斯)。

1.4 样品处理及溶液配制

称取营养粉1 kg，加6 L去离子水，搅拌均匀，超声60 ℃水浴浸提6 h，每次6 L去离子水相同条件下进行浸提，反复浸提3次，浸提液体经浓缩得稠浸膏490.1 g，密封冷藏备用。

1.5 方法

1.5.1 抗疲劳功效实验

1.5.1.1 动物分组 小鼠适应性饲养3 d后，随机抽取39只小鼠分为3组：正常对照组、营养粉低剂量组和营养粉高剂量组，每组13只。各组每日自由摄食饮水，每日灌胃1次，低、高剂量组灌胃剂量分别为3 g/(kg·d)、9 g/(kg·d)，正常对照组每日灌胃等量生理盐水。连续灌胃30 d。

1.5.1.2 抗疲劳实验方法 第30天给药1 h后，进行爬杆实验。将小鼠置于光滑玻璃棒的顶端，从实验开始到小鼠无力支撑从玻璃棒上掉落的时间记为小鼠的爬杆时间，实验结束后继续饲养。第31天给药1 h后，对3组小鼠进行用时1 h的游泳适应性训练，淘汰不适应游泳的小鼠，确定每组10只共30只小鼠进行负重游泳实验，继续饲养给药。第37天给药1 h后进行。实验操作参照胡远等[4]的报道，实验前所有小鼠称质量，每只小鼠的尾巴根部卷上重量为其自身体质量5%的铅皮，置于水温为(23±1) ℃，水深为30 cm的水桶中进行游泳实验，小鼠从开始游泳到力竭(小鼠沉入水下10 s仍不能冲上水面)的时间记为小鼠的负重游泳时间。

1.5.2 抗氧化功效实验

1.5.2.1 动物分组 小鼠适应性饲养3 d后，随机抽取40只小鼠分为4组：正常对照组、氧化模型组、营养粉低剂量组和营养粉高剂量组，每组10只。饲养条件及给药方式和剂量同“1.5.1.1”，连续灌胃38 d。

1.5.2.2 实验方法 第38天给药1 h后，除正常对照组外，对其余3组小鼠进行氧化损伤造模。造模操作参照苏德奇等[5]的报道，所有小鼠禁食过夜，次日末次给药后1 h，除正常对照组外均给予0.40 mg/kg溴代苯油，灌胃量0.2 mL/kg。22 h后称重记录，摘眼球取血并处死小鼠，迅速取肝脏，置于预冷的生理盐水中洗净，滤纸吸干后称重记录。取0.15 g组织放入2 mL EP管中，用眼科剪剪碎后按m∶v=1∶9的比例加入冰生理盐水1.35 mL，匀浆后离心(3 000 r/min，10 min)，取上清液得到10%肝匀浆，按后续实验需要分装为4管，-20 ℃冰冻备用。

1.5.2.3 试剂盒操作 肝组织中蛋白浓度测定运用BCA法测定，血浆和10%肝匀浆中的MDA含量、SOD活力和GSH-PX活力的测定，严格按照试剂盒说明书操作。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 复方赤芝营养粉的抗疲劳作用

由表1可知，与正常对照组对比，营养粉高、低剂量组的爬杆时间差异均有统计学意义(P<0.01)，爬杆时间明显延长，负重游泳时间均有延长，高剂量组的负重游泳时间差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 复方赤芝营养粉的抗氧化作用

2.2.1 复方赤芝营养粉对肝匀浆中MDA含量、SOD活性和GSH-Px活性的影响 由表2可知，与正常对照组对比，模型组小鼠的MDA含量和SOD活性差异均有统计学意义(P<0.01)，而GSH-Px活性差异无统计学意义，提示溴代苯诱导氧化损伤造模成功；与模型组比较，低剂量组与高剂量组的MDA含量均有所减少，其中低剂量组的MDA含量比高剂量的要低，低剂量组MDA含量差异有统计学意义(P<0.01)，低剂量组和高剂量组SOD和GSH-Px的活力差异无统计学意义。

2.2.2 复方赤芝营养粉对血浆中MDA含量、SOD活性和GSH-Px活性的影响 由表3可知，与正常对照组对比，模型组MDA含量、SOD活性差异均无统计学意义，GSH-Px活性差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，低、高剂量组MDA含量差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，且低剂量组MDA含量比高剂量组含量低；高、低剂量组的SOD活性和高剂量GSH-Px活性差异无统计学意义。

表1 复方赤芝营养粉对小鼠爬杆时间和负重游泳时间的影响Table 1 Effect of compound Ganoderma lucidum powder on the climbing time and swimming time in mice

与正常对照组比较：**P<0.01。

表2复方赤灵芝营养粉对氧化损伤小鼠肝匀浆MDA含量和SOD及GSH-Px活性的影响

与正常对照组比较：**P<0.01； 与模型组比较：△△P<0.01。

表3复方赤芝营养粉对氧化损伤小鼠血浆MDA含量和SOD及GSH-Px活性的影响

组别剂量/(g·kg-1)nc(MDA)/(mmol·L-1)SOD/(U·mL-1)nGSH-Px/(U·mL-1)正常对照组-109.78±1.6699.62±16.969355.30±24.86模型组-1010.46±1.3999.71±27.517319.07±31.54∗赤芝营养粉 低剂量组3107.64±0.71△△97.26±25.056310.14±36.58高剂量组9108.29±1.42△101.20±35.389328.49±20.64

与正常对照组比较：*P<0.05； 与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01。

3 讨论

疲劳在中医学中解释为“虚劳”，是生物体日常活动后产生的正常现象，即运动性疲劳。长期的运动性疲劳可能会影响机体正常功能甚至产生损伤。从传统中医理论的角度看，复方赤芝营养粉中赤芝、黄精、五味子补肾气，养阴生津；菟丝子、枸杞子滋补肝肾；桑葚补血滋阴、生津润燥；油菜花粉补肾固本；羊奶粉补肾虚、益精气。前有学者[6-8]研究表明，菟丝子、黄精、五味子等对小鼠有明显的抗疲劳作用。本研究结果也显示复方赤芝营养粉能够延长运动时间，且呈剂量依赖性，说明该营养粉可增强小鼠体质，延缓疲劳，增强体力。

脂质过氧化产物MDA会对细胞膜造成功能性损伤，导致机体衰老甚至引发疾病，其含量反映机体脂质的过氧化水平。体内重要的抗氧化酶如SOD和GSH-Px在保护机体清除过氧化产物和自由基的过程中发挥重要作用，抗氧化能力是反映机体抗衰老能力的重要指标[9-10]。本实验所采用的溴代苯氧化模型是保健食品功能评价常用的模型之一，溴代苯使细胞膜脂质过氧化从而引起肝细胞氧化损伤。以往的研究表明，赤灵芝多糖能够提高免疫抑制小鼠的抗氧化能力，降低小鼠体内MDA的含量[11-12]；五味子多糖能够提高小鼠的SOD活性并且降低MDA含量[13]；黄精多糖对心肌肥厚大鼠具有很好的体内抗氧化作用[14]。本研究结果中，营养粉低剂量组小鼠体内MDA的含量对比模型组明显下降，高剂量组小鼠体内MDA含量虽有下降但差异无统计学意义；SOD以及GSH-Px的活性对比模型组比较差异无统计学意义。说明复方赤灵芝营养粉具有一定的抗氧化功效，且服用低剂量的复方赤灵芝营养粉更能有效地减少机体过氧化产物，但对于抗氧化酶活性的影响及机制还需要进一步研究。