实验小型猪2型糖尿病模型的研究进展

古展辉，郭姣

(广东省代谢病中西医结合研究中心,广东药科大学，广东 广州 510006)

随着饮食条件改善，2型糖尿病已是高发、高危害、严重威胁人类健康的疾病。2016年，世界卫生组织全球糖尿病报告称糖尿病病人数量从1980年的1.08亿增加到2014年的4.22亿，低收入和中等收入国家的糖尿病患病率上升速度更快[1]。调查报告显示，我国糖尿病人群以2型糖尿病为主，占糖尿病患者总数的90%以上[2]。2017年，中国疾病预防控制中心慢病中心与北京大学公共卫生学院合作在JAMA上发表了我国糖尿病前期及糖尿病最新流行病学数据显示：糖尿病前期的比例为35.7%，成人糖尿病患病率为10.9%，在相同BMI国际标准分层水平亚洲人群中中国人患糖尿病的风险更高[3]。研究开发2型糖尿病防治新药极其重要，合适的2型糖尿病的动物模型则是其防治新药研发的必备工具。

2019年Abramson等[4]发表的论文报道了一种以胰岛素作为模型药物的口服大分子自导向系统，其中应用了大鼠进行急性和亚慢性毒性实验，体外猪胃和禁食猪模拟人体服药过程进行药动学实验，结果表明该系统提供的血浆中药物活性成分水平与皮下给药后的相当，具有替代皮下注射胰岛素治疗的潜力，为其他生物大分子的口服给药提供了可能。

啮齿类动物是生物医学研究中最常用的动物，拥有饲养成本低、伦理接受度高、繁殖能力强、转基因技术完善和可供参考的标准化方案多等优势。虽然啮齿动物模型的研究常常有助于发现通路和检验假说，但啮齿类动物和灵长类动物之间在代谢生理学方面存在较大差异[5]，在临床药效评价和安全性评价等转化医学研究领域存在局限，为更好开展糖尿病的防治研究和相关药物的药效评价，采用生理病理特征与人更为相近的实验动物进行研究尤为重要[6]。

非人灵长类动物在啮齿类动物模型的基础研究和人类临床研究之间起着关键的转译桥梁的作用，非人灵长类动物不仅在基因水平上和人类极为相似，如人类和恒河猴的基因组相似度约为93%，而且在代谢性疾病中的易感性相似，作为一种临床前动物模型,在研究人体代谢生理病理生理学方面的应用可以更加确定药物对人类的安全性和有效性；但其局限是在可供研究的动物数量有限、研究费用较高、实验技术与设备普及程度较低、还可能会面临伦理问题等[7]。

小型猪与啮齿类动物相比，在生理病理特征上与人更为相似，由于猪与人在基因序列及染色体结构上同源性很高，同时小型猪在心血管系统、消化系统、皮肤结构、糖代谢、脂代谢和生理生化指标与人类极为相似；与非人灵长类相比，小型猪容易获得、研究费用较低、伦理接受度高等，所以是特别适用于2型糖尿病病理机制研究和药物药效评价的实验动物。啮齿动物、小型猪和非人灵长类动物糖尿病模型优劣势对比见图1。近年来国内外有关实验小型猪2型糖尿病模型构建的方法及特点介绍如下。

图1啮齿动物、小型猪和非人灵长类动物糖尿病模型优劣势对比

Figure1Comparison of advantages and disadvantages of rodent,miniature pig and non-human primate diabetes models

1 糖尿病实验小型猪的品种

20世纪40年代国外就已开始进行实验小型猪的开发研究工作。国外实验小型猪主要品系为德国哥廷根系(Gottingen)，美国尤卡坦系(Yucatan)和汉福德系(Hanford)等。我国实验小型猪的开发研究从20世纪80年代才开始，目前国内已实验化的小型猪品系主要有版纳微型猪近交系、广西巴马小型猪、贵州小型猪、五指山小型猪近交系和西藏小型猪、蕨麻小型猪等。不同品系在不同的生命科学研究领域有各自的生物学优势与特长。见表1。

为能更好地开展疾病模型的相关科研工作，应充分考虑并利用好各种品系小型猪的上述生物学特点。

2 实验小型猪2型糖尿病模型制备的方法

高糖高脂饮食(HSHFD)可诱发小型猪出现典型肥胖，发生糖耐受降低和胰岛素抵抗综合征，从而建立2型糖尿病模型(见表2)；化学药物如链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)和四氧嘧啶(alloxan，ALX)能选择性的破坏胰岛β细胞，使胰岛素分泌量下降和血糖(Glucose，Glu)的水平升高，结合高糖高脂饮食促使小型猪产生2型糖尿病典型“三多一少”的症状(见图2)。刘汝文等[17]报道在制备糖尿病模型时未去势的小型猪成功率偏低，建立心梗模型时易室颤且心率和血压比去势猪更快和更高，提出用小型猪做营养代谢性疾病实验研究时建议使用去势猪更有利，且提早把猪去势便于保定操作和模型建立。

2.1 单纯高糖高脂饮食诱导

Low等[18]高糖高脂饮食喂养尤卡坦小型猪6个月发现小型猪出现肥胖、血脂异常和胰岛素抵抗并且系统性胰岛素抵抗的发生伴有血管功能障碍和动脉壁胰岛素信号异常。

Yan等[19]从健康巴马小型猪中根据空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)和60 min 静脉糖耐量试验(IVGTT)的实验数据分为2型糖尿病易感组和2型糖尿病耐受组，两组同时高糖高脂饮食饲养，结果表明易感组小型猪的各项生理指标均较耐受组小型猪更接近2型糖尿病症状，因此在单纯高糖高脂饮食诱导2型糖尿病时可考虑选择易感2型糖尿病的小型猪作为造模动物。

Liu等[20]将巴马小型猪随机分为对照组和高糖高脂组，6个月后，与对照组相比，高糖高脂组稳态模型评价胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)上升2.9倍，小型猪骨骼肌谷氨酸的表达下降，胰岛素敏感性下降24.8% 。

景国强等[21]认为高糖高脂饲养6个月能引起较为理想的2型糖尿病小型猪模型，具体表现为体质量增加，血糖升高，并出现血清TG、TC水平升高，GLP-1水平显著下降。

表1 各品系小型猪在生命科学研究中应用的特点[8-16]Table 1 Application characteristics of miniature pigs in life science research

表2高脂饲料配方对血液生理生化指标的影响[19-25]

Table1Effect of high-fat feed formula on blood physiological and biochemical indicators

成分百分比/%c(FPG)/(mmol·L-1)c(TG)/(mmol·L-1)c(TC)/(mmol·L-1)油脂5.04.43～8.130.55～1.072.41～4.7310.04.36～10.520.48～2.422.42～20.45蔗糖35.04.71～8.130.50～1.262.42～4.2037.04.70～12.520.54～2.423.00～20.45胆固醇0.04.70～8.500.56～1.262.42～5.002.08.02～12.521.78～2.4217.62～23.28

图2小型猪2型糖尿病模型不同造模方法的外形特点

Figure2Shape characteristics of miniature pig models of type 2 diabetes mellitus

Chen等[22]发现五指山小型猪和巴马小型猪在高糖高脂饲喂6个月后，开始出现肥胖、血清胰岛素升高和胰岛素敏感性下降等糖代谢异常现象，开始实验8个月后，五指山小型猪和巴马小型猪发展为糖尿病或出现2型糖尿病前期表现，中国农大小型猪出现胰岛素敏感性减低，而空腹血糖水平、血清胰岛素含量、胰岛素敏感指数和IVGTT在实验过程中一直无显著变化，表现出对高糖高脂饲料致糖尿病反应不敏感。

单纯高糖高脂饮食诱导小型猪2型糖尿病不但成模时间长，饲养成本高，而且体质量增长快不利于后续实验操作。 模型组给予不同配比的高脂饲料所得血液生化指标结果略有不同，给予更高比例的油脂和蔗糖使得小型猪的血糖和三酰甘油值更高，且外源性添加胆固醇会使得小型猪血液中胆固醇含量显著升高，从而增加患动脉粥样硬化和冠心病等心脑血管疾病的风险(见表2)。单纯高糖高脂饮食诱导容易获得肥胖或者代谢综合征模型，但要想获得典型的“三多一少”2型糖尿病模型需要半年以上到1年的造模时间[23]。

2.2 药物结合高糖高脂饮食诱导

常用于猪、啮齿动物、兔子和非人灵长类动物制备2型糖尿病的药物有链脲佐菌素和四氧嘧啶，两者均为具有毒性的葡萄糖类似物，能通过位于细胞膜上的葡萄糖转运蛋白2(glucose transporter 2，GLUT2)转运到细胞中。ALX产生有毒自由基通过坏死导致胰岛β细胞死亡；STZ一进入细胞就被分解产生游离的甲基亚硝基脲，诱导DNA片段化和加速细胞坏死[26]。二者选择性的破坏胰岛β细胞，使胰岛素分泌量下降和血糖水平升高，这两种药物既可以单独使用亦可联合应用，结合高糖高脂饮食可更快速的制备2型糖尿病模型。

STZ的半衰期较ALX的半衰期长，注射时的溶液较为稳定，STZ对胰岛β细胞外的细胞毒性较小，动物死亡率较低，因此STZ诱导造模的重复性比ALX的更好[27]。在制作小型猪2型糖尿病模型时，使用ALX可对肝、肾组织造成毒性损害，动物的死亡率较高，而且所制备的动物模型长期稳定性较差，1～2周后可由残存胰岛细胞代偿作用而使其恢复为正常状态；使用STZ要优于ALX，STZ造模快速稳定而且种属选择性不强，造模前不需要严格禁食等[28]。

田忠等[29]对小型猪静脉注射高剂量150 mg/kg STZ，观察肝肾功能指标发现肝功能基本维持正常，而肾小管的重吸收功能部分受损，证实STZ制备小型猪糖尿病模型的安全性和可靠性。

Ludvigsen等[30]对高脂肪高胆固醇饮食的哥廷根小型猪单次静脉给予高剂量125 mg/kg STZ，然后静脉注射67 mg/kg烟酰胺来保护部分胰岛β细胞，诱导后小型猪出现明显胰岛素抵抗，中度三酰甘油血症和重度高胆固醇血症。

肖国华等[31]每天给予版纳微型猪高糖高脂饲料，在1个月后腹腔一次性注射50 mg/kg STZ，7个月后耳缘静脉注射50mg/(kg·d) STZ，连续3 d，小型猪血糖、三酰甘油和总胆固醇水平升高，产生胰岛素抵抗，初步建立了较为理想的2型糖尿病动物模型。

Wu等[32]将广西巴马小型猪分成4组，其中10头为高糖高脂饲料喂养10个月(DM1-HH组)，4头为6个月高糖高脂饲料喂养，接着注射60 mg/kg STZ后继续喂养高糖高脂饲料4个月(DM2-HS组)，4头为注射60 mg/kg STZ后标准饮食喂养6个月，高糖高脂饲料喂养4个月(DM3-SH组)，10个月后，DM1-HH组10头猪中只有4头符合糖尿病模型标准，注射STZ的组别均符合糖尿病标准，且DM2-HS组胰岛素抵抗更为严重，认为先高糖高脂饲养一段时间再注射STZ可获得更严重2型糖尿病模型。

于健等[34]使用高糖高脂饲料喂养模型组小型猪11个月后给予腹腔注射STZ 100 mg/kg，并在1周后重复注射上述剂量1次，模型组FPG稳定维持在9.8～15.6 mmol/L水平，成功构建具有典型“三多一少”糖尿病症状的2型糖尿病小型猪模型。

吴延军等[35]在实验组巴马小型猪高糖高脂饮食6个月后按60 mg/kg 一次性静脉注射STZ，再连续观察3个月发现，制备出稳定性好、2型糖尿病特征明显的小型猪模型。

通过使用STZ或ALX等化学药物结合高糖高脂饮食能快速损伤胰岛β细胞、降低胰岛素水平导致高血糖，能建立典型2型糖尿病模型，但不具备肥胖特征，而且在选择药物诱导剂量时需考虑到不同品系对药物敏感性的不同，以便建立理想模型。见表3。

当使用较低剂量60 mg/kg STZ时，小型猪胰岛素长期代偿性升高；当使用中低剂量80～100mg/kg时，小型猪血糖较高且胰岛素分泌相对不足；当使用STZ造模的剂量过大时可能会出现酮症酸中毒致使小型猪死亡的现象[36]。见表3。

Vériter[37]等对猪静脉注射不同剂量的STZ，30～50 mg/kg剂量的STZ可重构胰岛内胰岛β细胞和α细胞的比例使之更接近于人的比例(人的比例为60%和25%，猪的比例为90%和8%)，胰岛α细胞的比例随着STZ剂量的增加而增加，使胰高血糖素的分泌增加，β细胞内cAMP浓度增加， 从而响应葡萄糖刺激诱导胰岛素分泌。注射30和50 mg/kg STZ后β细胞比例降低30%并不影响葡萄糖摄取，破坏30%的β细胞后没有明显的糖尿病迹象，而葡萄糖耐受不良和糖尿病发生时β细胞分别减少了50%和90%，这就解释了为什么低剂量的STZ对猪的葡萄糖代谢没有影响。

3 生物学指标的变化

2型糖尿病成模小型猪毛发粗糙无光泽，活动量减少，精神萎靡，反应迟钝，饮水量增多，排尿量增多。与正常对照组小型猪比较，药物STZ或ALX破坏胰岛细胞造模的小型猪体质量显著下降而后才缓慢上升。

2013版中国糖尿病防治指南诊断标准[38]为：⑴典型的“三多一少”糖尿病症状和随机血糖≥11.1 mmol/L(200 mg/dL)或加上⑵空腹血糖≥7.0 mmol/L(126 mg/dL)或加上⑶葡萄糖负荷后2h血糖≥11.1 mmol/L(200 mg/dL)。2018年美国糖尿病学会发布的2018年糖尿病医学诊疗标准[39]认为空腹血糖、餐后2h血糖和糖化血红蛋白仍是诊断糖尿病和糖尿病前期的标准，但如果测得的血糖水平和糖化血红蛋白之间明显不一致则需考虑是否血红蛋白变异干扰血红蛋白检测的可能。

表3 STZ静脉注射用量对血糖(FPG)、胰岛素(FINS)和胰岛素抵抗指数(HOME-IR)的影响Table 3 Effect of STZ intravenous injection on blood glucose,insulin and insulin resistance index

研究表明，小型猪的胰腺发育、结构及葡萄糖代谢机制与人类的相似，空腹血糖值也与人类的相近，故可用人类糖尿病诊断标准作为参考。成功构建2型糖尿病模型的小型猪会导致胰岛素抵抗水平升高，胰岛素敏感性下降，糖耐量实验葡萄糖利用率下降，血清三酰甘油和胆固醇水平升高，C肽水平下降，餐后GLP-1的分泌减少，血清肌酐水平下降，尿酸增加，尿素减少。衡量胰岛β细胞功能的经典指标是胰岛素，C肽与胰岛素有一个共同的前体是胰岛素原，一个胰岛素原分子经酶切后，裂解成一个分子的胰岛素和一个分子的C肽，二者从分泌颗粒同时释放到毛细血管参与血液循环中，并且C肽不会被肝脏破坏，半衰期明显较胰岛素长，故测定血中C肽水平更能准确反映胰岛β细胞的分泌功能。

2型糖尿病小型猪的病理结果显示：胰岛明显萎缩，胰岛β细胞数目明显减少；肾脏脂肪沉积，肾小球出现肥大、系膜扩张、炎性细胞浸润、透明小管扩张；肌纤维普遍出现萎缩，部分肌纤维排列紊乱而且明暗带不规则，部分肌纤维的细胞核增多、形态及位置异常；牙周结缔组织明显疏松排列混乱，且网状纤维破坏，血管化明显，局部出现富含血管的肉芽组织和大量的炎性细胞浸润[11,23]。2型糖尿病小型猪各组织的糖脂代谢、炎性反应和细胞凋亡等病理特征与人类2型糖尿病特征相似。

4 转基因动物模型

利用转基因和基因打靶技术来建立动物疾病模型是目前动物模型的研究热点之一。自从2001年第一头体细胞核移植转基因克隆猪诞生后，转基因小型猪糖尿病模型在技术上才获得突破[40]。

Renner等[41]培育INSC94Y转基因猪建立了永久性新生儿糖尿病猪模型，INSC94Y转基因猪β细胞胰岛素分泌较对照组明显减少，内质网严重扩张，且伴发的白内障随着年龄的增加病情越来越严重。Streckel等[42]的GIPRdn转基因出现猪胰岛β细胞数量减少，胰岛素分泌减少，体质量的增加也减少，葡萄糖耐量受损等的糖尿病症状。Kong[43]等使用取自五指山小型猪猪胚胎成纤维细胞作为体外体细胞核移植的供体细胞，以特定的多顺反子系统构建分别在猪肝脏组织特异性表达11β-HSD1基因，在胰岛β细胞特异性表达hIAPP基因和CHOP基因的三基因过表达载体，制备了3头转基因五指山仔猪，结果显示肝脏中11β-HSD1的过表达使肝脂参数升高，胰岛细胞hIAPP和CHOP的过表达导致β细胞发育迟缓和凋亡。

国内实验小型猪用于制作转基因小型猪糖尿病及相关模型还较为欠缺，虽然高糖高脂饮食诱导或结合药物诱导可以建立2型糖尿病模型，但由于糖尿病是涉及许多机制参与的多基因遗传的复杂疾病，通过转基因和基因打靶技术制作的模型可用于糖尿病相关基因的功能及致病机制的研究。

5 展望

不同的方法构建的2型糖尿病模型具有一定独特的生物学特征，可适合不同的研究需求。应根据研究的需求，采用不同的方法复制相应的2型糖尿病模型。见表4。

表4构建小型猪2型糖尿病模型的不同方法及其特点和应用范围

Table4EDifferent methods of constructing miniature pig type 2 diabetes mellitus and their characteristics and application scope

造模方法特点应用范围HSHFD肥胖引起的2型糖尿病模型2型糖尿病前期和糖尿病期及其并发症的药效评价及发病病理机制研究STZ/ALX+HSHFD快速形成“三多一少”2型糖尿病模型2型糖尿病晚期和糖尿病期及其并发症的药效评价及发病病理机制研究转基因技术糖尿病相关基因缺失或过表达遗传性糖尿病的病理机制研究

致谢：

本文撰写过程中得到贝伟剑研究员提供的宝贵建议。