含季铵盐型单体釉质粘结剂的抗菌性与粘结性的研究

吕 芳 叶之慧

佳木斯大学附属口腔医院，黑龙江省佳木斯市 154007

龋白斑是一种常见于固定正畸治疗的并发症，大约有一半的患者会发生龋白斑，变形链球菌是口腔中的常居菌群，也被认为是一种重要的致龋菌[1]，因此，理想的正畸粘结剂必须抑制或减少细菌的生长。与其他抗菌剂相比，季铵盐是一类具有优良抗菌性的化合物，它还有渗透性强、性能稳定，对皮肤有轻微刺激、低毒、低腐蚀和长效生物学等优点，在工业和制药业等领域已被广泛应用[2-3]。在本实验中，将季铵盐单体加入到正畸釉质粘结剂中以观察其是否能抑制变形链球菌，对正畸粘结剂本身的粘结强度是否有影响，以此证明其是否具有临床应用意义，为日后改善抗菌齿科粘结材料奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验菌株与主要试剂 季铵盐(深圳市金腾龙实业有限公司)，变形链球菌(Streptococcus mutans，S．m),ATCC25175(购买自上海瑞楚生物科技有限公司)，培养基为脑心浸液肉汤(BHI)培养基，京津釉质粘结剂，75%乙醇溶液，无菌生理盐水。

1.2 实验方法

1.2.1 变形链球菌的培养：变形链球菌常规复苏，鉴定为纯培养后，取单个菌落置于BHI 肉汤中并在37℃的厌氧环境下培养直至使用。

1.2.2 正畸粘结剂样本的制备：用球磨法将季铵盐型抗菌单体和正畸托槽粘结剂作如下处理，分别以1∶99，2∶98，3∶97，4∶96和5∶95(g)的重量比混合，分别命名为SYZ1、SYZ2、SYZ3、SYZ4和SYZ5，然后在干燥相对封闭的操作箱内将两者的混合体在玛瑙研钵内研磨以实现两种材料的均匀混合。因此，含抗菌单体的正畸粘结剂含抗菌剂的浓度为：1%、2%、3%、4%、5%(w/w%)。

1.2.3 最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定：向含有8ml BHI培养液的15只试管中分别加入用BHI培养液配制的季铵盐型单体溶液(100g/ml、200g/ml、300g/ml、400g/ml、500g/ml)各1.0ml，然后向各试管中加入1.0ml的变形链球菌菌悬液，浓度为1×106CFU/ml(血球计数器计数)，使季铵盐型抗菌单体的终浓度分别为10g/ml、20g/ml、30g/ml、40g/ml、50g/ml。将所有试管置于摇床中振荡培养2h。取每瓶培养液1.0ml，10倍系列稀释至10-3后涂布于BHI琼脂平板上0.1ml，置于恒温培养箱中，37℃培养24h，计数菌落数，存活菌数与添加的菌数相近的最低浓度即为季铵盐型抗菌单体的最低抑菌浓度(MIC)。按季铵盐型抗菌单体的终浓度分别为30g/ml、35g/ml、40g/ml、45g/ml、50g/ml设5个试验组，具体方法同MIC操作步骤，计数菌落数后，平皿中不长菌或平均菌落数<3个的最低浓度即为季铵盐型单体最低杀菌浓度(MBC)。同时，将未加季铵盐型单体的溶液作为对照组，每组设3个重复样品，并重复测定MBC和MIC 3次。

1.2.4 抗菌性能检测：使用相同的标准模具将SYZ1、SYZ2、SYZ3、SYZ4、SYZ5和空白对照组制成厚度为2mm的30mm×30mm试验样品。所有样品在测试前用75%乙醇溶液擦拭，用无菌盐水反复洗涤，在超净工作台上自然干燥以备后用。取0.2ml的变形链球菌液(连续转接2次，用无菌盐水稀释至约1×107CFU/ml的菌液)分别滴加到空白对照试验片和试验片上。用无菌镊子将薄膜覆盖于样品上，将菌液与样品均匀接触，然后置于无菌培养皿中，并在厌氧环境下培养24h。加入20ml 生理盐水，反复洗涤，充分摇匀，将变形链球菌洗脱液10倍系列稀释至10-3，在平板培养基上接种0.1ml，37℃下培养24h后菌落计数。实验结果判定：抗菌率R% = (A-B)/A×100%，A：空白对照样品平均回收菌数 (CFU/片)，B：抗菌样品平均回收菌数(CFU/片)。

1.2.5 抗剪切性能检测：选择因正畸拔除的无龋坏前磨牙60颗，要求拔除半年内，非四环素牙，非氟斑牙，肉眼观察牙釉质无裂缝及缺损，随机分为6组，每组10颗，分别标记为A、B、C、D、E、F组 (A组：未添加季铵盐型单体的正畸托槽粘结剂组；B组：添加1%季铵盐型单体的正畸托槽粘结剂组；C组：添加2%季铵盐型单体的正畸托槽粘结剂组；D组：添加3%季铵盐型单体的正畸托槽粘结剂组；E组：添加4%季铵盐型单体的正畸托槽粘结剂组；F组：添加5%季铵盐型单体的正畸托槽粘结剂组)。自凝树脂包埋离体牙，仅暴露颊面，并用浮石和橡皮杯清洁和抛光，标准均质化粘接。在37℃的人工唾液浴中浸泡1周, 并进行约200次冷热循环模拟，以此充分模拟口腔环境。通过万能测试机检测抗剪切强度，加载速度为1mm/min，匀速加载至托槽脱落并记录最大剪切力值(N)。托槽底面=积托槽长×托槽宽，约11.7mm2。剪切粘结强度计算公式：剪切粘结强度=最大载荷/托槽底面积。

1.2.6 粘结剂残留指数 (ARI) 检测：在10倍放大镜下观察残留在托槽底板牙釉质上的粘结剂量，并记录粘结剂残留指数。ARI评分标准[4]：0分：牙面无粘结剂残留；1分：牙面粘结剂残留面积小于托槽底板面积的50%；2分；牙面粘结剂残留面积大于托槽底板面积的50%；3分：粘结剂全部保留于牙面。

2 结果

2.1 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC) 季铵盐型抗菌单体对变形链球菌具有较强的抑制作用，最低抑菌浓度为20g/ml。低于20g/ml的浓度与阴性对照组的结果一致,对细菌生长没有抑制作用。季铵盐型抗菌单体对变形链球菌的最低杀菌浓度为45g/ml，MBC值为MIC的2.25倍。

2.2 抗菌性检测结果 表1中的结果表明，具有季铵盐型单体的正畸釉质粘结剂对变形链球菌有明显的抗菌作用。根据统计学分析，与空白对照组相比，各组含不同比例的季铵盐抗菌剂的正畸粘结剂差异有显著统计学意义(P<0.01)。实验结果表明，与其余组比较，在抗菌剂添加比例为4%时，抗菌率最高。

表1添加不同比例季铵盐单体抗菌剂的正畸釉质粘结剂对变形链球菌杀菌率的比较

2.3 剪切粘结强度结果 6组离体牙的托槽抗剪粘结强度值见表2。统计学分析后，添加不同比例季铵盐型单体的正畸托槽粘结剂组的剪切粘结强度无明显差异，表明随着抗菌剂添加比例的增加，不会影响粘结剂的抗剪切性能。

表2添加不同比例季铵盐单体抗菌剂正畸釉质粘结剂的托槽抗剪切粘结强度值

2.4 粘结剂残留指数(ARI)分值 ARI记分可作为辅助指标来衡量粘结剂与牙釉质表面的粘结效果。根据表3中的实验结果，A组空白对照和5个实验组的ARI得分非常接近，差异无统计学意义，这也与剪切粘结强度实验结果一致。

3 讨论

正畸患者越来越多，寻求具有抗菌性能的新功能性齿科材料尤为重要。近年来，一些学者提出了“可聚合抗菌剂”的概念[6-7]，它是一种由抗菌基团与可聚合基团组成的一类既具有稳定的抗菌活性，又能发生聚合反应的分子，广泛应用于工业及制药业等行业。目前，大多数“可聚合抗菌剂”都是基于季铵基团并发挥抗菌作用的，因此它们统称为季铵型抗菌单体。季铵盐抗菌单体可与粘结剂中的常规单体交联，因此对粘结剂本身的粘结性能没有不利影响[8-9]。

表36组离体牙脱槽脱落后的ARI分值

本研究主要观察添加不同比例季铵盐单体抗菌剂正畸釉质粘结剂抗菌性及抗剪切性能。首先，将变形链球菌作为评价菌株，结果显示季铵盐型抗菌单体对其具有较强的抑制作用，MIC为20g/ml，而MBC为45g/ml，MBC值为MIC的2.25倍，季铵盐单体抗菌剂的适宜添加量为4%时，抗菌性能最强。

粘接系统作为牙体组织与修复体之间的桥梁，使用抗菌粘接剂是预防继发龋的不二之选。季铵盐型抗菌单体粘结剂在固化前可起到消毒作用[10]，快速杀灭去龋后残余细菌，固化后，可以通过接触抑制作用阻止细菌通过粘结界面侵袭深部牙本质，以此预防继发龋的发生，延长修复体使用寿命[11]。一种抗菌正畸粘结剂若要满足临床的要求，必须在具备长久的抗菌活性的前提下同时具有足够的粘结强度，正畸治疗中矫治器托槽能达到5.6～7.8MPa的抗剪切强度即可满足临床需要[12]。研究表明,当体外实验的抗剪切强度>14MPa时,移除托槽时会引起牙釉质损害[13]。在本实验中，使用万能测试机测试各组样本托槽的抗剪切粘结强度，实验结果表明，不同比例的季铵盐抗菌单体的托槽抗剪粘结强度均符合临床应用范围，是具有临床可应用性的。

综上所述，季铵盐型抗菌单体的使用可赋予托槽稳定的抗菌性能而不影响粘结剂的粘结性能，具有临床应用意义。