CRY2过表达对肝癌细胞增殖及生物钟基因、蛋白表达的影响

许静，孙诚谊，喻超，何晓晓，杨盛力

(1贵州医科大学，贵阳550000；2贵州医科大学肝胆胰脾重点实验室；3华中科技大学同济医学院附属梨园医院)

生物钟是参与协调机体各种组织器官昼夜节律的一种内源性调控系统，与人体各项生理活动密切相关[1～3]。生物钟的基本分子机制主要由一系列核心元件组成的转录、翻译负反馈环构成，包括PER1-3、CRY1-2、CLOCK、BMAL1、TIMELESS、NPAS2、NR1D1、DEC1、DEC2和RORA等。目前研究[4～7]表明，生物钟调控系统紊乱与多种肿瘤的发生发展密切相关，其机制可能是生物钟对肿瘤细胞的增殖、侵袭及耐药等恶性生物学行为有一定影响。CRY2在人骨肉瘤、乳腺癌、大肠癌等多种实体肿瘤中表达上调，且其高表达可促进肿瘤细胞恶性生物学行为[8，9]。本课题组前期研究发现，生物钟基因在肝细胞癌中的表达具有显著差异，对肝癌的发生发展具有显著意义[14，15]。研究[10]发现，生物钟基因可通过调控下游多种信号通路从而影响细胞周期及相关基因的表达，最终调控肿瘤细胞的生物学功能。2018年5～9月,本研究观察了过表达CRY2的肝癌细胞系HepG2增殖能力变化，及细胞中多种生物钟基因和蛋白的表达变化，从而研究CRY2对肝癌细胞生物钟网络调控的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 DMEM培养基、PBS和胎牛血清购自美国Hyclone公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司；CCK-8检测试剂盒；PCR引物由武汉谷歌生物科技有限公司提供；鼠抗人CRY1单克隆抗体、兔抗人CRY2多克隆抗体及兔抗人CLOCK多克隆抗体购于Abcam公司；兔抗人β-actin单克隆抗体购于Santa Cruz公司；鼠抗人PER3多克隆抗体购于Novus公司；兔抗人PER1、PER2、BMAL1多克隆抗体购自美国Proteintech公司；肝癌细胞系HepG2来自中国典型物种保藏中心；CRY2过表达病毒上清液及阴性对照病毒上清液的构建和鉴定由上海吉凯基因公司进行。

1.2 HepG2细胞分组及CRY2过表达载体转染 于培养瓶中培养HepG2细胞，待细胞处于对数生长期，用胰酶消化细胞后均匀接种于编号1～6的6孔板中，每孔各加入2 mL含10%胎牛血清及1%抗生素的DMEM培养液，第1～3孔先加入5 μL的CRY2过表达病毒上清液(实验组)，第4～6孔先加入5 μL阴性对照病毒上清液(对照组)，并每孔均加入2 μL聚凝胺(polybrene)促进转染。于5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h后更换含10%胎牛血清及1%抗生素的DMEM培养液，每48 h更换1次培养液，连续7 d后实验组获得CRY2稳定过表达的HepG2细胞。以未转染的HepG2细胞作为空白组。

1.3 HepG2细胞增殖情况观察 实验组、对照组、空白组的细胞分别接种于培养瓶中，待细胞长满培养瓶的85%～90%时，用胰酶消化后离心收集，用含10%胎牛血清及1%抗生素的DMEM培养液重悬、计数，以2×103/mL接种于96孔板中，每孔加100 μL的培养液，每20孔分为一组，共三组。于转染后24、48、72、96 h，各组分别选取5孔检测细胞增殖情况。每孔弃培养基后，加入血清与CCK-8(100∶10)混合液110 μL，置于37 ℃、5% CO2条件培养箱中培养2 h，采用酶联免疫检测仪于波长460 nm处检测各孔吸光度值，表示细胞增殖能力。

1.4 HepG2细胞中生物钟基因检测 采用real-time PCR法检测实验组和对照组细胞中的生物钟基因CLOCK、BMAL1、PER1、PER2、PER3、DEC1、DEC2、CRY1、CRY2、NPAS2 mRNA。收集实验组和对照组细胞，TRIzol法提取总RNA，计算RNA浓度，将RNA反转录合成cDNA，再以cDNA为模板，进行基因扩增。反应体系：2×SYBR PremixEx TaqTMⅡ 12.5 μL，0.4 μmol/L的上、下游引物各1 μL，50 ng/μL的DNA模板2 μL，三蒸水8.5 μL。反应条件：95 ℃预变性60 s，95 ℃变性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，扩增40个循环，72 ℃再延伸 10 min。以β-actin为内参，以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。重复3次实验取平均值。相关生物钟基因及内参基因引物序列见表1。

表1 生物钟基因及内参基因引物序列

1.5 HepG2细胞中生物钟基因蛋白检测 将对数生长期的实验组和对照组HepG2细胞用RIPA裂解液置于冰上裂解30 min，用细胞刮刀收集后于4 ℃、12 000 r/min离心机中离心5 min，收集上清液。用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。加入1/4体积的5×loading buffer，100 ℃加热10 min。取10 μg蛋白样品溶液于聚丙烯酰胺凝胶中电泳，凝胶湿转PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入相应的一抗抗体，4 ℃静置孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min后加入相应抗兔或抗鼠二抗IgG抗体，孵育1 h后洗膜3遍；暗室下将ECL发光液滴加在PVDF膜上，化学发光仪曝光，用凝胶成像系统拍照并测量蛋白条带灰度值。以目的蛋白和内参蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取均值。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 随着转染时间延长，各组细胞增殖能力呈增高趋势。转染48、72、96 h后，实验组细胞增殖能力较对照组和空白组降低(P均<0.05)。详见表2。

表2 转染24、48、72、96 h后各组细胞增殖能力比较

注：与同时点对照组、空白组相比，*P<0.05。

2.2 两组HepG2细胞中生物钟基因及蛋白表达比较 实验组细胞中PER1、PER2、PER3、CLOCK、CRY1、CRY2、BMAL1、NPAS2、DEC2 mRNA及蛋白相对表达量均高于对照组，DEC1 mRNA及蛋白相对表达量均低于对照组(P均<0.05)。详见表3、4。

表3 实验组与对照组细胞中生物钟基因表达比较

注：与对照组相比，*P<0.05。

表4 实验组与对照组细胞中生物钟基因蛋白表达比较

注：与对照组相比，*P<0.05。

3 讨论

生物钟是昼夜节律的分子基础，它是一种内源性的自身调节的循环过程，通过转录、翻译、翻译后修饰等一系列过程，形成节律性的生理周期[11～13]。细胞内生物钟基因主要由一系列呈节律表达的生物钟基因及其相应蛋白产物在转录和翻译水平调控。这种转录-翻译反馈环路的生物节律即是生物钟的基本分子机制。[14～16]。CRYs可与生物钟基因PERs形成复合体，从而调控生物钟基因网络[17]。目前已有报道生物钟基因CRY2在多种肿瘤组织中的表达具有显著差异，并调控下游肿瘤相关信号通路，从而参与恶性肿瘤的发生发展[18]。CRY2作为生物钟基因网络中关键环节，其在恶性肿瘤中表达上调是否导致生物钟基因网络中其他生物钟基因表达的改变，目前尚未明确。

生物钟基因除了其固有的生物钟效应外，近年来越来越多的研究表明生物节律的异常表达还与肿瘤的发生、发展、疗效和预后等密切相关。生物钟基因CRY2即是已发现的几种参与肿瘤发生发展的核心调控基因之一[19～21]。CRY2是昼夜节律核心振荡器复合物的关键组分，其表达可受其他生物钟基因调控。研究[13，16]表明生物钟基因CLOCK/ARNTL形成的异二聚体可促进CRY2表达上调，CRY2与PERs形成异二聚体与CLOCK/ARNTL相互作用在反馈环中抑制CRY2表达上调。CRY2通过调控生物钟基因网络，参与细胞DNA损伤检查点控制和重要细胞周期相关基因表达调节。同时，还有研究[17]表明CRY2突变可增加细胞对基因毒性药物诱导的细胞凋亡的敏感性，同时也抑制p53突变小鼠恶性肿瘤的早期发展。此外，乳腺癌细胞CRY2表达下调更容易导致DNA损伤修复机制的破坏[18]。上述研究表明，CRY2可能与肿瘤的发生发展及预后密切相关，与患者的DNA损伤和化疗效果也有关[19,20]。因此，深入研究其中分子生物学机制有助于提高肿瘤治疗效果、改善患者预后。

本研究细胞增殖实验结果显示，CRY2过表达后，HepG2细胞增殖能力显著下降，提示CRY2基因表达变化影响肝癌细胞的增殖。我们进一步检测两组细胞中生物钟基因及蛋白发现，CRY2过表达后，肝癌细胞中PER1、PER2、PER3、CLOCK、CRY1、BMAL1 mRNA及蛋白表达水平均上调。上述研究结果提示，CRY2上调后可能通过调控生物钟网络从而抑制肝癌细胞的增殖能力，然而CRY2调控生物钟网络的具体分子生物学机制仍不清楚。本研究证实了CRY2过表达可显著抑制肝癌细胞的增殖能力，同时能够影响其他生物钟基因的表达，进一步说明了生物钟基因CRY2及其调控的生物钟网络在肝癌的恶性生物学行为中发挥着重要作用。未来我们将深入研究CRY2调控生物钟网络、调控肝癌细胞生物学行为的分子机制，最终为肝癌的临床诊断及治疗提供新思路。