系统性红斑狼疮早发动脉粥样硬化模型小鼠的建立

郭晓玲，朱春红

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是自身免疫介导的,以免疫性炎性反应为突出表现的弥漫性结缔组织病，可造成皮肤、肾脏、血液等全身多系统受累。近年发现，SLE患者发生动脉粥样硬化的风险显著增加， 50%以上患者存在中到重度动脉粥样硬化，已成为导致死亡的主要原因[1]。目前该病尚无根治办法，而且常用治疗药物均不理想，不良反应较多，严重影响远期预后和生存质量。造成这些问题的根本原因是该病发生机制复杂，人们对其发病规律及影响因素还缺乏全面认识。因此，揭示SLE早发动脉粥样硬化的核心发病机制，对于发现药物靶点和疾病治疗具有重要意义。本研究通过小鼠模型的建立初步探讨SLE早发动脉粥样硬化。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 降植烷购自Sigma公司；三酰甘油(triglyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol ，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol ,HDL-C)、尿素氮(blood urea nitrogen ，BUN)、肌酐(creatinine, CRE)定量试剂盒等购自南京建成公司；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒购于beyotime公司。

1.2 方法 选择10只ApoE-/-敲除小鼠(ApoE-/-，C57BL/6背景，12周龄，雌性)为实验组，10只C57BL/6小鼠为对照组，体质量(22±2)g，均购自天津市奥臣实验动物销售有限公司(动物批号1601826)。适应性饲养2周后开始实验，实验过程中对动物的处置符合伦理学标准。实验组ApoE-/-小鼠一次性腹腔注射降植烷0.5 ml/只，再高脂喂养8周建立模型，对照组C57BL/6小鼠腹腔注射等量生理盐水，每组10只。实验过程中观察小鼠毛发、饮食、活动状况等一般情况，绘制体重变化曲线。实验结束后眼球取血，12 000 r/min离心，10 min，分离血清，冻存备用。同时，取各组小鼠肾脏组织，置中性甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片， HE染色，80%、90%、95%、100%乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察各组小鼠肾脏组织形态变化。

1.3 观察指标 取两组小鼠外周血样本，根据试剂盒说明书，采用分光光度计检测血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRE、BUN及肾功能指标。

2 结 果

2.1 小鼠肾功能与血脂水平检测结果 实验组小鼠毛色暗淡甚至剥脱，活动减少，一般状态较差。实验组CRE、BUN肾功能指标明显恶化，同时TC、TG及LDL-C水平均显著升高，而HDL-C水平明显降低，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01，表1)。

2.2 组织形态学变化 HE染色结果显示，实验组肾小球细胞增多、肿大，可见大量炎性细胞浸润，肾小管空泡变性，基底膜异常增厚，系膜增生(图1)。

表1 两组小鼠肾功能、血脂水平比较

表1 两组小鼠肾功能、血脂水平比较

指标对照组实验组CRE(μmol/L)3.48±1.0336.87±3.89①BUN(mmol/L)1.86±0.9512.72±3.09①TC(mmol/L)6.52±3.4017.53±2.32①TG(mmol/L)0.49±0.14 1.30±0.21①LDL-C(mmol/L)0.30±0.301.25±0.33①HDL-C(mmol/L)1.66±0.17 0.79±0.17①

注：与对照组比较，①P<0.01

图1 两组小鼠肾脏组织HE染色特点(HE，×400)

3 讨 论

SLE是一种以产生自身抗体，免疫复合物沉积，巨噬细胞组织浸润及组织损伤为特点的自身免疫性疾病，近年来，随着医学迅速发展，其预后显著改善，生存期和总体预后均有所提高。但是，生存期延长易导致患者重要脏器，如心血管受累，使得动脉粥样硬化性心血管疾病成为SLE疾病后期最重要的并发症之一，亦成为SLE远期死亡的主要原因[2]。进一步揭示，SLE本身引起的慢性血管炎性反应性改变和长期的免疫系统紊乱是导致SLE患者动脉粥样硬化性疾病发病增加的一个主要原因，即使努力控制已知危险因素后, SLE 患者出现心血管事件的相对危险率仍高出健康人10倍。因此，SLE早发动脉粥样硬化的研究日益受到关注，而理想的动物模型是对深入探讨疾病机制及提出有效防治对策的重要物质基础。本研究以ApoE突变小鼠作为研究对象，采用自发性动脉粥样硬化小鼠模型，结果显示实验组血清CRE、BUN水平比正常对照小鼠显著增加，同时实验组肾脏组织形态明显改变,肾小球细胞增多、基底膜异常增厚、系膜细胞增生，证实动脉粥样硬化小鼠具有狼疮样临床表现。

目前，国内外已建立多种SLE合并动脉粥样硬化模型小鼠，但是成功率有限。文献[3]发现，自发性模型MRL/lpr狼疮鼠即使予以高脂喂养也几乎不能出现动脉粥样硬化病变。另外，有研究人员通过将同品系的Fas-/-小鼠，lpr(fas)或 gld(fasl)基因突变小鼠与ApoE-/-或 LDLr-/-小鼠交配繁殖；或通过诱发ApoE-/-或 LDLr-/-小鼠，均可成功建立SLE 伴动脉粥样硬化模型[4-6]。但该方案繁殖纯化周期较长，不确定因素较多。降植烷(Pristane)是可引起炎性反应和增强免疫反应的类异戊二烯烷烃，可被单核吞噬细胞吞噬，使T、B淋巴细胞增殖聚集，通过线粒体损伤途径诱发细胞凋亡产生核抗原，由于T细胞高度活化、B细胞反应性增高，产生多种抗体，启动自身免疫反应，常常能成功诱发狼疮[7]。有研究报道，应用Pristane诱导小鼠建立动物模型所涉及的小鼠种类、周龄、Pristane剂量等均有差异，尚无统一标准[8，9]。因此，本研究采用ApoE-/-小鼠腹腔注射Pristane建立SLE伴发动脉粥样硬化模型，以期为充实SLE早发动脉粥样硬化动物模型的资料提供更多依据。结果显示，12周龄实验组小鼠注射Pristane后即可呈明显的狼疮表现，而一般自发性动脉粥样硬化模型鼠出现SLE症状约需20周以上，可见Pristane刺激能大大缩短实验周期。同时，实验组小鼠肾炎性反应症状明显，组织形态学显示肾小球硬化和主动脉动脉粥样硬化，血CRE和BUN等肾功能检测指标显著升高，血脂水平异常，具有和临床相似的狼疮表型及动脉粥样硬化表现，表明成功构建SLE合并动脉粥样硬化小鼠模型。

综上所述，SLE是发病机制复杂的自身免疫性疾病，对其进行有效的干预治疗已取得巨大进展，近年来，主要通过自发性和实验性诱导动物模型进行更深入病因和发病机制的探索，因此建立便利、稳定的模型动物具有重要意义。本研究使用Pristane诱导自发性动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠建立SLE合并动脉粥样硬化动物模型，制备方法简便，一次注射即可。此外，与自发性动物模型病程较长不同，该造模方案实验周期短，对实验条件的要求相对较低，且实验复制成功率高，能够获得与人类相似的发病情况。因此，本研究建立的动物模型可为进一步揭示疾病的发病机制及探索新的治疗策略提供借鉴作用。