白藜芦醇对产蛋后期蛋鸡肝脏抗氧化酶活性和mRNA表达的影响

■李生杰 赵国先 刘彦慈 马可为 郝艳霜 刘观忠 冯志华*

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定071000；2.河北保定职业技术学院，河北保定071000）

白藜芦醇（Resveratrol，Res），一种称为反式3,5- 4，三羟基双苯乙烯的化学物质，当植物受到某些细菌的感染或者是处于恶化的环境中时，能够产生这种天然多酚类的物质，为一种抗毒素，具有保健和多种重要的生物学功能。天然存在于多种植物或水果，如葡萄、松树、花生和决明子。Res具有抗氧化、防腐、抗肿瘤的作用[1]，另外还能治疗炎症、心脏病，能发挥一定作用，并且还能调节脂代谢紊乱，使其恢复正常平衡状态[2]。近年来，食品添加剂、保健品、化妆品、医药等行业研究生物活性物质对身体健康有益的生物药理作用，使一些生物活性物质得到广泛使用。在畜禽养殖中，有研究表明，鸡肉和猪肉的品质以及肉鸡的免疫功能都会因为有机物的添加而提高，但是在蛋鸡方面的研究未见报道。本试验旨在研究日粮中添加不同量的Res 对产蛋后期蛋鸡抗氧化能力和相关基因表达有何影响，并初步探究其分子机理，为绿色饲料添加剂的研发提供理论依据，促进蛋鸡产业健康可持续发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

Res（纯度≥50%，上海诺特生物科技公司提供）。

1.2 试验设计与试验日粮

试验采用单因子完全随机区组设计，挑选360只60 周龄健康无病且体重和产蛋率相近的京粉1 号蛋鸡，随机分成5 组，每组6 个重复，每个重复有12 只鸡。对照组饲喂基础日粮（基础日粮组成和营养水平见表1）。试验组在基础日粮上分别添加0.05%、0.10%、0.20%、0.40%量的Res。基础饲粮在参照NRC（1994）和中华人民共和国农业行业标准NY/T33—2004 的基础上，结合京粉1 号蛋鸡饲养管理手册配制。预试期1周，试验期为8周。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.3 饲养管理

半开式3层实心笼，上、中、下三排梯笼架平均分布。利用天然和人工两种补光方式，保持其强度为14 LX 且每天要有16 h 光照。自由采食，喂干粉，于每天上午8：30 和下午14：00 各喂1 次，采用乳头式饮水。安排专人负责防疫程序，每天捡蛋一次，每周进行一次鸡粪清理。每天注意察看鸡的精神状态，及时清除死鸡并记录数量。

1.4 样品采集

在试验结束时最后1 d时，每个重复选2只蛋鸡，每组共选12只，总共60只。首先对其禁食供水，12 h之后于颈静脉进行采血，将所采血液静置至有部分血清析出之后，再将其在3 500 r/min条件下离心10 min，最后收集血清分装保存于-20 ℃，待测血清抗氧化指标。将所选鸡只屠宰，在颈静脉进行放血，去毛之后在右侧肝脏和胸肌同一部位取样，并用生理盐水冲洗样品表面血渍，之后用5 ml离心管盛放且立即放入液氮中进行冷冻一段时间，最后放置于-20 ℃保存留用，用以测定抗氧化酶酶活活性；另外在左侧肝叶中部位置切取两块筋膜较少的组织，分装于两个1.5 ml无RNA 酶的EP 管中，迅速投入液氮（开膛后2 min内），然后放置于-80 ℃冰箱中保存，分子样品在1 个月内检测。

1.5 抗氧化指标的测定

1.5.1 肝脏抗氧化酶活性的测定

试剂的配制和试验操作均按说明书进行，测定的指标包括总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定。

1.5.2 肝脏中抗氧化酶mRNA相对表达量的测定

1.5.2.1 总RNA提取

从肝脏中提取总RNA，并使用电泳检测RNA的完整性。电泳检测-RNA 电泳结果(1.5%琼脂糖，1×TAE 电泳缓冲液，紫外透射光下察看并拍照)(见图1)。

1.5.2.2 反转录

实验试剂为第一链cDNA 合成试剂盒（AMV First Strand cDNA Synthesis Kit）(SK2445)，cDNA 第一链合成依照说明书操作。将上述模板cDNA 分装到若干小管中-20 ℃保存备用。

1.5.2.3 肝脏PGC-1α、Nrf2、Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD基因的引物设计与合成

PGC-1α、Nrf2、Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 基因的引物设计见表2，上海生物工程技术公司提供合成的引物。

图1 蛋鸡肝脏总RNA 凝胶电泳图

1.5.2.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测

试验样本：该cDNA 样本在机器上被稀释为模板的8倍。

实时定量PCR 试剂：ABI SybrGreen PCR Master Mix（2X）。

定 量PCR 仪：LightCycler480 Software Setup(Roche 罗氏)。

PCR反应步骤：

①配制反应混合液10 μl SybrGreen qPCR Master Mix（2X），1 μl引物F(10 μM)，1 μl引物R(10 μM)，6 μl dd H2O，2 μl Template (cDNA)。

②PCR 循环条件：95 ℃3 min，95 ℃15 s，60 ℃40 s，进行40个循环。

1.6 数据处理与统计分析

以重复为单位，使用SAS 8.0 软件进行试验数据的分析，使用One-way ANOVA进行方差分析，并进行一次线性回归分析。邓肯法用于显著性差异的多重比较。结果以“X±标准差SD”表示。

表2 目的基因及内参Real-time PCR 引物序列

2 结果与分析

2.1 对肝脏抗氧化酶活性的影响

日粮中添加Res 对蛋鸡肝脏抗氧化指标的影响见表3。由表3 可见，蛋鸡日粮中添加不同水平的白藜芦醇对其肝脏中MDA 活性均无显著影响（P＞0.05）。随着Res 添加水平的提高，蛋鸡肝脏T-AOC、T-SOD 和GSH-Px 的活性显著增加（P＜0.01），且与Res添加量之间呈线性相关（P＜0.01）。

表3 Res对蛋鸡肝脏抗氧化指标的影响

2.2 对肝脏中抗氧化酶mRNA相对表达量的影响

日粮中添加Res 对蛋鸡肝脏PGC-1α、Nrf2、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD mRNA 表达的影响见表4。由表4可见，日粮中添加不同水平的白藜芦醇对蛋鸡肝脏中PGC-1α和Nrf2 mRNA 的表达量均无显著影响（P＞0.05）。随着Res添加水平的升高，蛋鸡肝脏Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的mRNA表达量均呈显著线性增加（P＜0.01），0.20%组、0.40%组Mn-SOD 的mRNA 表达量较对照组极显著提高（P＜0.01），但两组间无显著性差异（P＞0.05）。0.10%、0.20%组和0.40%组Cu/Zn-SOD 的mRNA 表达量对照组极显著提高（P＜0.01），三组间无显著性差异（P＞0.05）。

表4 Res对蛋鸡肝脏PGC-1α、Nrf2、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD mRNA表达的影响

3 讨论

3.1 Res对产蛋后期蛋鸡肝脏抗氧化指标的影响

现代规模化、集约化生产条件下，产蛋鸡易受到生产过程中的免疫接种、饲养密度、热或冷应激、圈舍氨气及惊吓等因素的影响，导致蛋鸡机体的氧化还原平衡状态受到破坏而发生氧化应激反应造成抵抗力下降，生产性能降低，影响生产效益。随着产蛋鸡进入产蛋后期，其身体机能各项指标都有所下降，如果鸡只饲养密度过高以及长期排卵，这时候容易引起氧化应激反应。随着鸡的日龄增加，其体内的一些抗氧化酶活性下降，导致其氧化/抗氧化平衡系统发生紊乱，机体不能及时清除掉自由基，导致自由基的数量有所增加，代谢紊乱、组织器官功能下降、细胞功能的退化均和自由基的数量增多有关，影响蛋鸡健康和产蛋性能。

总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和丙二醛（MDA）可以反映机体的抗氧化能力。抗氧化功能综合评价指标使用总抗氧化能力（T-AOC），机体自由基代谢的情况以及受到环境刺激时其代偿能力情况都可用总抗氧化能力大小来反映。GSH-Px在还原型谷胱甘肽(GSH)转变为氧化型的谷胱甘肽(GSSG)方面发挥重要作用，机体中的过氧化氢及脂质过氧化物也可被其清除掉，达到保护机体的目的。超氧化物歧化酶具有非常重要的作用，可以防止发生一些生理病变，使机体内的氧自由基保持在一定的数量，能够清除体内的超氧阴离子，并且可以和超氧阴离子自由基发生歧化反应，生成过氧化氢，被认为是抗氧化系统的第一道防线。例如，当身体处于病理或者衰老状态时，由于SOD 的突然降低而引起的自由基急剧增加。脂质过氧化物的含量水平可以由MDA含量的大小来间接反反映，因为是脂质过氧化物所氧化形成的最终产物，说明活性氧（ROS）自由基攻击对机体脂质有损伤作用。本试验结果显示，肝脏中T-AOC、T-SOD 和GSH-Px的活性亦随着白藜芦醇水平的升高而显著增加。提示白藜芦醇增强机体抗氧化功能的机理是提高体内抗氧化酶的活性，抑制脂质过氧化反应。与本结果类似，周玲芝[3]报道，急性酒精肝损伤小鼠血清与肝组织SOD、GSH-Px活力会因白芦藜醇添加而升高，血清与肝组织MDA含量会随着白芦藜醇的添加而下降。张彩云等[4]报道，0.10%白藜芦醇可显著提高血清T-AOC 水平，显著降低血清MDA 水平，0.20%白藜芦醇能显著提高T-SOD活性及其在肉鸡肝脏T-AOC水平，显著降低肝组织MDA含量；Sridhar等[5]研究报道，在肉仔鸡日粮中添加白藜芦醇可以提高其抗氧化水平，并有效抵御AFB1-诱导的毒性反应。窦健霖等[6]报道白藜芦醇可增加血清抗氧化酶GSH-PX、GST、CAT、T-SOD、GSH 活性，降低MDA 含量，这一作用呈一定的量效关系。另有研究表明，白藜芦醇可使鹌鹑血清中MDA含量呈线性下降；肝脏中SOD[7]、CAT和、GSH-Px 活性以及Nrf2 的表达成线性增加[8]。Baxter[9]发现，白藜芦醇阻止自由基或脂质（peroxidation)氧化的生物学效率是95%，而传统的抗氧化剂如VE和VC分别是65%和37%。Zhu 等[10]报道，在大鼠日粮中添加白藜芦醇可以降低血清MDA 浓度，同时增加肝组织的谷胱甘肽含量和GPx 活性以及血清SOD 水平。Zhang 等[11]报道，育肥猪日粮中添加白藜芦醇可以提高肌肉中T-AOC、GPx 活性和GPx mRNA 水平，提示其抗氧化能力的增强。

3.2 Res对产蛋鸡肝脏Nrf2、PGC-1α、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD mRNA水平的影响

调控抗氧化酶基因表达的主要核转录因子为Nrf2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2），被激活进入细胞核与抗氧化酶作用元件结合后调控抗氧化酶的基因表达。PGC-1α 作为一种具有多重功能的辅因子，除了在能量代谢中具有重要作用外[12]，还可通过GSH-Px 和SOD 等抗氧化酶有效调控活性氧代谢[13]。Wu 等[14]报道，PGC-1α可通过刺激核呼吸因子Nrf2 转录调控与ARE调节有关的抗氧化酶的基因表达[15]来诱导SOD 和GSH-Px 等酶的产生[16]。在当前研究中，白藜芦醇对蛋鸡肝脏中PGC-1α和Nrf2 mRNA 的表达量均无显著影响（P＞0.05），但有升高的趋势，这说明白藜芦醇可能在一定程度上激活PGC-1α-Nrf2-ARE-抗氧化酶反应通路增加相关抗氧化酶的mRNA表达。

SOD是一种金属酶，其所包含的蛋白质部分和结合到蛋白活性部位的金属离子都能够影响它的酶活性和理化性质。按其所含金属辅基的不同，将其划分为Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/ZnSOD、Ni-SOD、Mn/FeSOD和Fe/ZnSOD 六种不同的酶，目前研究较多的两种酶为Cu/ZnSOD 和Mn-SOD。原核生物和真核生物甲壳动物的线粒体中含有大量的锰超氧化物歧化酶，细胞质中也含有少量的这种酶；Cu/ZnSOD 广泛存在于细胞中，其含量占到总SOD 的90%，其作用是维持氧自由基的平衡、清除转移超氧阴离子自由基、集体防御氧化损伤，是一种重要的金属酶。在本研究中，日粮中添加适宜水平的白藜芦醇可使蛋鸡肝脏Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的mRNA表达量显著增加，与本试验肝脏和血清中T-SOD 和GSH-Px 等抗氧化酶的活性增加的结果是一致的。抗氧化酶基因表达量的增加可以促进酶活的提高，因此，白藜芦醇可能以增加Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 表达的方式发挥其抗氧化作用，其详细机制还需进一步深入研究。

4 结论

本试验的研究结果显示，饲粮中添加适量白藜芦醇可以增强蛋鸡血清中谷胱甘肽过氧化物酶和总超氧化物歧化酶的活性，使血清丙二醛含量下降；随着白藜芦醇水平的升高，肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶、总超氧化物歧化酶的活性和总抗氧化能力会相应增强，肝脏中的Mn-SOD和Cu/Zn-SOD酶的mRNA表达量也会上升。由此可见，白藜芦醇可能是通过调节抗氧化酶基因的表达和活性变化发挥抗氧化作用，但其具体作用机理仍需要进一步研究。