体外产气法评估荞麦秸秆、油菜、苜蓿干草和玉米青贮的组合效应

■李海庆 王 萌 周玉香

(宁夏大学农学院，宁夏银川750021)

我国秸秆种类较多，但动物消化率较低，利用率不高[1]。荞麦在我国种植广泛，荞麦秸秆也是一种较好的粗饲料来源[2]。近年来我国油菜因其生产总量呈持续增长的趋势，也成为了重要的农作物秸秆之一[3]。苜蓿是一种蛋白含量高的豆科饲草。研究证明，秸秆作为日粮中唯一的粗饲料时，无法在瘤胃微生物中完全发酵，容易造成消化率降低[4]，通过将低质的秸秆与其它优质的粗饲料进行组合饲喂，可以提高秸秆的利用率，缓解我国秸秆资源浪费等问题[5]。布同良（2006）[5]通过体外产气法研究在日粮中用青贮玉米与羊草组合时，可产生正组合效应。张吉鹍等（2007）[6]研究在玉米秸秆日粮中补充40%～60%的苜蓿可以更高效的利用秸秆资源。

本试验拟采用体外培养技术，通过将荞麦秸秆、油菜、苜蓿干草和青贮玉米进行不同比例的组合搭配，在体外进行培养试验。通过检测多项发酵指标，用以评估这几种粗饲料的组合效应。

1 试验材料与方法

1.1 试验动物及饲养管理

选用4月龄，体重在23 kg左右，体况良好的滩羊公羊3只，进行瘤胃瘘管手术，待瘤胃瘘管固定后护理30 d开始试验。试验前，对圈舍进行消毒，对羊只进行驱虫、健胃等管理。饲养日粮按照《肉羊饲养标准》（NY/T816—2004）合理配制营养全面的基础日粮。基础日粮营养配方见表1。每日饲喂2次，自由饮水。

表1 基础日粮营养配方（DM基础）

称取4.0 g精粗比为3∶7的日粮作为体外培养底物，精料按照基础日粮配方中的精料配方。粗饲料按照粉碎过40目筛后的荞麦秸秆、油菜、苜蓿干草和青贮玉米按不同配比组合。组合比例（%）为油菜20∶青贮80，荞麦20∶苜蓿80，荞麦40∶苜蓿60，油菜20∶苜蓿80，油菜40∶苜蓿60，荞麦20∶青贮80。并按此组合顺序设定为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组，Ⅰ组设定为对照组。每种组合3个重复，采用体外发酵技术，在0、3、6、12、24 h测得各时间点发酵指标，最后所测值根据组合效应综合指数（MFAEI）的计算公式，整理数据。

1.2 体外试验准备

1.2.1 瘤胃液采集

试验期间在早饲前通过瘤胃瘘管抽取瘤胃液，取出后立即放入预热39 ℃并通有CO2的保温瓶中，带回实验室。随后经8层纱布过滤后迅速分装进通有CO2的恒温培养瓶中，每个培养瓶装入40 ml瘤胃液。

1.2.2 培养液制备

培养液参照张爱忠(2005)[7]的方法进行配制，每个培养瓶中加入80 ml 培养液。试验前39 ℃预热并通入CO2。

1.2.3 模拟人工瘤胃产气装置

取250 ml 培养瓶，置于恒温水浴摇床中，摇床温度设置为39 ℃、摇速50次/min。试验过程中培养瓶内产生的气体可排出到注射器，用于记录产气量，记录后将气体通过三通阀注入集气袋中，用于检测甲烷含量。

1.3 测定指标与方法

各试验点结束后，分别统计和测定各组合的产气量、pH值、干物质消化率、氨态氮浓度、挥发性脂肪酸（VFA）、微生物蛋白（MCP）、甲烷含量。

1.3.1 产气量的测定

分别在发酵开始后0、3、6、12、24 h通过三通阀上端的注射器读取并记录不同时间点的产气量。

1.3.2 pH值的测定

发酵结束后用pHS-2 型酸度计直接测定培养瓶中的瘤胃液的pH值。

1.3.3 干物质消化率的测定

1.3.4 氨态氮浓度的测定

参照冯宗慈等（1993）[8]的方法测定。

1.3.5 挥发性脂肪酸的测定

用GC-2010 气相色谱仪测定。汽化室中载气为N2，分流比为20∶1，温度250 ℃，筑炉温度100 ℃，火焰监测器(FID)温度250 ℃，检测器载气为H2流量40 ml/min，空气流量450 ml/min。检测样品进样量为1 μl。

1.3.6 微生物蛋白的测定

用差速离心法将，将细菌沉淀，再用考马斯亮蓝G-250法测定[8]。

1.3.7 甲烷排放量的测定

利用岛津GC-2010 气相色谱仪测定。测定条件为筑炉温度60 ℃，检测器70 ℃；载气为氮气(N2)，检测样品进样量为1 ml/次。

甲烷排放量=产气量×每毫升甲烷浓度

1.3.8 单项组合效应指数及多项组合效应综合指数的计算

式中：A1——对照组各个培养时间点各指标数值；

A2——各组各个培养时间点各指标数值；

A3——在每个时间点A2总和的平均数。

多项组合综合效应指数（MFAEI）为各单项指标的加和值。

1.4 数据统计与处理

试验数据用Excel 记录并作简单处理后，采用SAS 8.2软件包中的ANOVA过程进行方差分析，多重比较用Duncan's法。

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2 结果与分析

2.1 不同比例秸秆组合体外发酵指标的综合评定（见表2）

表2 不同比例秸秆组合体外发酵指标的综合指数评定

在精粗比为3∶7的日粮条件下，以荞麦100%组为发酵参考组，对产气量、pH值、干物质消化率、挥发性脂肪酸、氨态氮浓度、微生物蛋白、甲烷浓度进行单项组合效应和多项组合效应综合指数（MFAEI）评定。以SFAEI 评定时，VFA 以油菜20∶苜蓿80 组值最高，消化率以油菜40∶苜蓿60组最高，氨态氮以油菜20∶苜蓿80组最高，产气量以荞麦20∶青贮80组最高，pH 值以荞麦20∶苜蓿80 组最高，MCP 以油菜20∶苜蓿80组最高。用MFAEI对各项指标进行评定时发现，油菜20∶青贮80组合效应值最高，荞麦20∶苜蓿80组次之。

2.2 不同比例秸秆组合对体外培养挥发性脂肪酸的影响（见表3）

在日粮精粗比3∶7 情况下，由表3 可知，挥发性脂肪酸的浓度均随培养时间的增加而有所增加。3 h对照组与试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ组均差异极显著（P＜0.01），与试验Ⅳ组无显著差异（P＞0.05）；6 h对照组与各试验组均有极显著的差异（P＜0.01），试验Ⅱ组与试验Ⅵ组无显著性差异（P＞0.05）；24 h对照组与试验组均有极显著的差异（P＜0.01），12、24 h 试验Ⅱ组和试验Ⅵ组无显著性的差异（P＞0.05）。

表3 不同比例秸秆组合的体外培养VFA总浓度(mmol/l)

2.3 不同比例秸秆组合对体外培养干物质消化率影响（见表4）

在日粮精粗比3∶7情况下，由表4可见各试验组的干物质消化率随培养时间逐渐升高。3 h对照组与试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组均差异不显著（P＞0.05），与试验Ⅵ组差异显著（P＜0.05），与试验Ⅴ组差异显著（P＜0.05）；6 h对照组与试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组均差异不显著（P＞0.05），与试验Ⅴ、Ⅵ组差异极显著（P＜0.01）；12 h对照组与试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组、试验Ⅵ组均差异极显著（P＜0.01），与试验Ⅴ组差异不显著（P＞0.05）；24 h对照组与试验各组均差异极显著（P＜0.01）。

表4 不同比例秸秆组合的体外培养干物质消化率(%)

2.4 不同比例秸秆组合对体外培养产气量的影响（见表5）

表5 不同比例秸秆组合的体外培养产气量(ml)

在日粮精粗比3∶7情况下，由表5可见，3 h对照组与试验Ⅱ、Ⅲ组差异不显著（P＞0.05），与试验Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组差异极显著（P＜0.01）；6 h对照组与试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ组差异极显著（P＜0.01），与试验Ⅱ组和试验Ⅴ组差异不显著（P＞0.05）；12 h对照组与试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组差异极显著（P＜0.01），与试验Ⅱ组差异不显著（P＞0.05）；24 h 对照组与试验Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组均差异极显著（P＜0.01），与试验Ⅱ组、试验Ⅲ组差异不显著（P＞0.05）。

2.5 不同比例秸秆组合对体外培养氨态氮浓度的影响（见表6）

表6 不同比例秸秆组合的体外培养氨态氮浓度的影响(mg/100 ml)

在日粮精粗比3∶7 情况下，由表6 可见，在试验开始3 h对照组与其它五组试验组均差异不显著（P＞0.05）；6 h 对照组与试验Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ组差异显著（P＜0.05）；12 h 时，对照组与试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组差异极显著（P＜0.01），；24 h 对照组与试验Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ组差异显著（P＜0.05），与试验Ⅲ组差异不显著（P＞0.05）。

2.6 不同比例秸秆组合对体外培养甲烷排放量的影响（见图1）

图1 不同比例未处理秸秆组的体外培养甲烷排放量

在日粮精粗比3∶7 情况下，由图1 可见，对经过24 h的体外培养后产生的气体进行甲烷浓度的测定，发现试验Ⅲ组甲烷排放量最多，对照组较其它五组排放量都低，并且差异极显著（P＜0.01）。甲烷排放量的顺序依次为：试验Ⅲ组＞试验Ⅴ组＞试验Ⅳ组＞试验Ⅵ组＞试验Ⅱ组＞试验Ⅰ组。

2.7 不同比例秸秆组合对体外培养微生物蛋白含量的影响（见表7）

表7 不同比例秸秆组合的体外培养微生物蛋白含量(mg/100 ml)

在日粮精粗比3∶7 情况下，各试验组微生物蛋白含量随着培养时间的增长呈下降趋势。试验在3 h直到试验结束24 h 对照组与试验组均差异极显著（P＜0.01）。在24 h试验Ⅱ组微生物蛋白含量最高，顺序依次为：试验Ⅱ组＞试验Ⅲ组＞试验Ⅳ组＞对照组＞试验Ⅵ组＞试验Ⅴ组。

2.8 不同比例秸秆组合对体外培养pH值的影响（见表8）

表8 不同比例秸秆组合的体外培养pH值

3 讨论

通过对不同饲料进行组合，可以提高单个饲料的消化率，组合后的饲料其能量和蛋白利用率也会有所改变。如果不考虑饲料间的互作效应，将会导致对日粮营养价值评估的不准确[9]。饲料组合后指标较复杂，如果只考虑其中一种或几种指标很难达到准确的权衡。因此组合效应的综合指数就解决了这个难题。王旭（2003）[10]在2003年运用体外法研究了粗饲料混合后的组合效应，并且首次用多项组合效应指数（MFAEI）进行研究。于腾飞等（2012）[11]利用体外瘤胃发酵技术对花生蔓与其他粗饲料之间组合效应进行研究，得出了与花生蔓产生最优组合的粗饲料及最佳搭配比例。本试验采用人工模拟瘤胃发酵体外培养法，并采用多项组合效应指数（MFAEI）评估荞麦秸秆、油菜秸秆与苜蓿干草、青贮玉米间的组合效应。

瘤胃内挥发性脂肪酸是碳水化合物经过微生物发酵的主要产物，是衡量瘤胃内微生物活性的主要指标，更是反刍动物生存、生长、泌乳、繁殖的重要能源[12]。当瘤胃中总挥发性脂肪酸提高时，可以间接的说明瘤胃内的消化率提高，瘤胃的发酵效果较好[13]。本试验中挥发性脂肪酸的含量随着体外培养时间的增长均呈上升的趋势。

消化率是评定饲料组合效应的重要指标，饲料组合后的表观消化率不等于各单一饲料消化率的总和，因此也就有了组合效应[14]。夏科等（2012）[15]通过对粗饲料组合效应中能量、消化率指标的研究，得出了饲料间可以产生正组合效应的饲料组合，提高了饲料的消化率。本试验中试验Ⅰ组24 h 消化率达到了37.19%，其组合效应综合指数也最高.

瘤胃内微生物作用会产生气体，微生物活力越高，产气量越大，发酵程度也就越好。本试验中对照组的产气量最高，达到了532 ml，同时对照组的消化率也较其它试验组高，证明产气量和消化率是呈高度正相关的，这与Blummel 等(1997)[16]的研究是一致的。唐赛勇(2009)[17]通过对玉米青贮和稻秸之间进行组合效应研究，发现瘤胃干物质降解率和产气量的组合效应排序是一致的。本试验中，24 h的干物质消化率大小的顺序为对照组＞试验Ⅱ组＞试验Ⅲ组＞试验Ⅴ组＞试验Ⅵ组＞试验Ⅳ组，24 h的产气量的顺序为对照组＞试验Ⅱ组＞试验Ⅲ组＞试验Ⅴ组＞试验Ⅵ组＞试验Ⅳ组，同干物质消化率的排序也是一致的。

瘤胃NH3-N 是综合反映反刍动物蛋白质营养价值的重要参数。瘤胃内NH3-N 含量是一个动态平衡的过程，被降解后产生NH3-N，产生的NH3-N 可以与酮酸合成微生物蛋白质，而大多数情况下饲料降解产NH3-N 的速率远超过利用NH3-N 的速率。本试验NH3-N浓度并无规律性变化，试验经过24 h发酵后其NH3-N浓度均呈正组合效应，说明试验的组合日粮有利于蛋白的分解。

甲烷的产气量多少可以在一定程度上反映出能量的消化率[18]。赵丽媛等（2014）[19]通过研究添加商业外源性纤维分解酶制剂及其组合对玉米秸秆体外发酵和甲烷生成的影响，发现这种方法可以降低甲烷的排放量。本试验中对照组甲烷排放量最低，组合效应综合指数最高。

瘤胃内微生物蛋白质的浓度是检测微生物对NH3-N 的利用率的重要指标[20]。微生物生长的过程中能量和蛋白质重要的营养物质，动物机体中能氮比例适中，可以提高瘤胃微生物合成微生物蛋白的效率[21]。试验Ⅱ组中苜蓿占80%，苜蓿中蛋白含量较高补充了荞麦秸秆蛋白含量低的缺点，试验结果显示24 h 的试验Ⅱ组的微生物蛋白浓度最高。本试验各试验组微生物蛋白含量均差异极显著，这也可以更直观的表现出饲料之间组合效应差异[22]。

本试验经过人工瘤胃发酵处理后的饲料组合pH值维持在5.57～5.93 的正常范围内，表明模拟瘤胃装置是正常的。维持正常的pH 值是瘤胃发酵的前提。本试验从开始到结束，各试验组pH值均差异不显著。

4 结论

通过对荞麦秸秆、油菜秸秆、苜蓿干草、青贮玉米6种不同比例的组合，进行体外培养和综合评定发现，油菜20∶青贮80 组合效应值最高，荞麦20∶苜蓿80组次之。