原发性痛风性关节炎患者外周血单个核细胞三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2变化情况及其意义研究

文钟，青玉凤，周京国，谢文光，易婷，朱丹，陈刚，李梦兰，童晓霞

痛风是由于血尿酸水平异常升高，尿酸盐（MSU）晶体析出并沉积于组织或器官引起的一组临床综合征［1］。空腹血尿酸水平男性 ＞420 μmol/L（7.0 mg/dl）、女性 ＞357 μmol/L（6.0 mg/dl））即为高尿酸血症。高尿酸血症是痛风发病的生化基础，嘌呤代谢紊乱和尿酸排泄减少均可导致血尿酸升高。而在血尿酸生成增多的原因中嘌呤代谢紊乱导致血尿酸生成增多仅占10%，剩下的90%均与尿酸转运蛋白导致尿酸排泄减少有关［2］。三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2（ABCG2）作为一种重要的尿酸转运蛋白，在促进尿酸排泄中起关键性作用。研究显示，欧洲人群中10%的痛风患者跟ABCG2异常表达相关［3］。既往国内外对ABCG2尿酸转运的相关研究主要集中于肾脏、肝脏、肠道、胆管的ABCG2表达，方法也主要集中于动物模型的构建及细胞转染技术［3-6］。针对痛风患者外周血单个核细胞（PBMCs）的ABCG2研究尚未发现相关报道。为此，本研究通过RT-qPCR、Western blotting法比较男性原发性痛风性关节炎患者与健康体检者PBMCs ABCG2 mRNA及蛋白的表达差异，进一步探讨ABCG2在原发性痛风性关节炎发病过程中可能起到的作用，以期为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入标准：符合1977年美国风湿病协会（ACR）制定的原发性痛风性关节炎相关诊断标准［7］；初诊患者；未进行任何治疗（包括抗炎镇痛及降尿酸药物治疗）。排除标准：血液系统疾病；肾脏疾病；药物等引起的继发性痛风；自身免疫性疾病和其他炎性疾病。选取2016年6月—2017年2月于川北医学院附属医院风湿免疫科门诊就诊及住院的男性原发性痛风性关节炎患者（GA组）82例，其中急性期痛风（AGA亚组）和间歇期痛风（IGA亚组）患者各41例。年龄17～80岁，平均年龄（46±16）岁。依据患者血尿酸水平进一步分为血尿酸＜420 μmol/L痛风亚组（NUA亚组）31例、血尿酸≥420 μmol/L痛风亚组（HUA亚组）51例。

另选取同期川北医学院附属医院体检中心的男性健康体检者（HC组）46例，年龄18～78岁，平均年龄（47±13）岁。本研究经川北医学院附属医院伦理委员会批准，受试者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器与试剂

1.2.1.1 主要仪器 紫外分光光度计（Agilent 公司），低温高速离心机5417R（Eppendorf 公司），Q12K Flex型RT-qPCR仪（Applied Biosystem公司，美国），PCR扩增仪（BIO-RAD公司，美国），电泳仪（BIO-RAD公司，美国），凝胶成像系统（BIO-RAD公司，美国），电泳仪（BIO-RAD公司，美国），小型垂直式蛋白质电泳槽（BIO-RAD公司，美国），转膜仪（BIO-RAD公司，美国），酶标仪（Benchmark公司，德国），-80 ℃超低温冰箱（青岛海尔股份有限公司）。

1.2.1.2 主要试剂 人外周血淋巴细胞分离液（天津灏洋生物公司），Trizol试剂（Invitrogen公司），荧光染料试剂盒Power SYBR Green PCR Master Mix（ABI公司，美国），琼脂糖（北京艾德莱生物科技有限公司），GreenView核酸染料（成都博瑞克生物技术有限公司），聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，BIO-RAD公司，美国），GAPDH抗体（Ruiying Biological公司），ABCG2抗体（Abcam公司，美国），辣根过氧化物酶（HRP）标记的免抗鼠IgG二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2.2 设计引物 依据Gene Bank中人ABCG2及内参β-肌动蛋白（β-actin）进行序列设计，并用于RT-qPCR检测。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。

1.2.3 检测指标 采集受试者清晨空腹静脉血，采用全自动生化分析仪（ Beck Man Coulter Unicel DxC 800）检测血尿酸、肌酐、胱抑素C（Cys-C）、超敏C反应蛋白（hs-CRP）水平；采用血细胞分析仪（LH750）检测红细胞沉降率（ESR）。

1.2.4 血标本采集及PBMCs提取 采集受试者清晨空腹外周静脉血5 ml（肝素钠抗凝），3 000 r/min离心5 min（离心半径20 cm）分离血浆，加入等量磷酸缓冲盐溶液（PBS）混匀，将已混匀的静脉血缓慢加入人淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心5min（离心半径20 cm）分离PBMCs，加入3 ml PBS，2 000 r/min离心10 min（离心半径20 cm），再转移至1.5 ml焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的EP管中备用。

1.2.5 PBMCs总RNA提取及cDNA制备 将提取的PBMCs加入Trizol试剂，严格按照操作提取总RNA，以紫外分光光度仪测定RNA。D260/D280在1.8～2.0为合格。将合格的RNA浓度调整为100 ng/ml。cDNA的合成严格按照反转录试剂盒说明书，第一步反转录反应条件为：42 ℃ 2 min；第二步反转录反应条件为：42 ℃ 15 min；终止反应。将cDNA产物于-80 ℃冻存备用。

1.2.6 RT-qPCR法检测PBMCs ABCG2 mRNA表达水平 将cDNA以20 μl反应体系进行RT-qPCR扩增：SYBR® Premix Ex Taq ™ Ⅱ （2X）10.00 μl，ROX Dye Ⅱ（50×） 0.40 μl，上游引物（10 μmol/L）0.15 μl，下游引物（10 μmol/L）0.15 μl，cDNA 2.00 μl，双蒸水7.30 μl。反应条件：95℃预变性10 min，两步法扩增：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min共40个循环。操作均在Q12K Flex型RT-qPCR扩增仪中进行，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA表达水平。

1.2.7 Western blotting法检测PBMCs ABCG2表达水平PBMCs提取步骤同上，取40 μl进行凝胶电泳、转膜、电转，脱脂奶粉封闭液封闭1 h。加入特异性一抗（兔抗人ABCG2抗体或GAPDH抗体），4 ℃孵育过夜，磷酸盐吐温缓冲液（TBST）洗涤后加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗室温孵育2 h，洗涤后曝光显影。采用Image J图像分析软件扫描分析条带灰度值，以目的蛋白与GAPDH的条带灰度值比值代表目标蛋白的相对表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；非正态分布计量资料以M（QR）表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验；相关性分析采用Spearman秩相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PBMCs ABCG2 mRNA表达水平比较 GA组PBMCs ABCG2 mRNA表达水平高于HC组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表1 ABCG2及β-actin引物序列Table 1 ABCG2 and beta-actin gene primer sequences

表2 GA组与HC组PBMCs ABCG2 mRNA表达水平比较〔M（QR）〕Table 2 Expression of ABCG2 mRNA in PBMCs in GA group and HC group

AGA亚组、IGA亚组、HC组PBMCs ABCG2 mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中IGA亚组PBMCs ABCG2 mRNA表达水平高于AGA亚组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HC组PBMCs ABCG2 mRNA表达水平低于IGA亚组，差异有统计学意义（P＜0.05）；AGA亚组与HC组PBMCs ABCG2 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表3）。

表3 AGA亚组、IGA亚组、HC组PBMCs ABCG2 mRNA表达水平比较〔M（QR）〕Table3 Expression of ABCG2 mRNA in PBMCs in AGA subgroup，IGA subgroup and HC group

NUA亚 组、HUA亚 组、HC组 PBMCs ABCG2 mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中HUA亚组PBMCs ABCG2 mRNA表达水平高于NUA亚组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HC组PBMCs ABCG2 mRNA表达水平低于HUA亚组，差异有统计学意义（P＜0.05）；NUA亚组与HC组PBMCs ABCG2 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表4）。

表4 NUA亚组、HUA亚组、HC组PBMCs ABCG2 mRNA表达水平比较〔M（QR）〕Table 4 Expression of ABCG2 mRNA in PBMCs in NUA subgroup，HUA subgroup and HC group

2.2 PBMCs ABCG2表达水平比较 AGA亚组、IGA亚组、HC组PBMCs ABCG2表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中IGA亚组PBMCs ABCG2表达水平高于AGA亚组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HC组PBMCs ABCG2表达水平低于IGA亚组，差异有统计学意义（P＜0.05）；AGA亚组与HC组PBMCs ABCG2表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表5、图1）。

表5 AGA亚组、IGA亚组、HC组PBMCs ABCG2表达水平比较（±s）Table 5 Expression of ABCG2 protein in PBMCs in AGA subgroup，IGA subgroup and HC group

表5 AGA亚组、IGA亚组、HC组PBMCs ABCG2表达水平比较（±s）Table 5 Expression of ABCG2 protein in PBMCs in AGA subgroup，IGA subgroup and HC group

注：与AGA亚组比较，aP＜0.05；与IGA亚组比较，bP＜0.05

组别 例数 ABCG2 AGA亚组 41 0.45±0.16 IGA亚组 41 0.73±0.27a HC组 46 0.48±0.14b F值 5.858 P值 0.008

图1 Western blotting 法检测AGA亚组、IGA亚组、HC组PBMCs ABCG2 表达水平的凝胶电泳图Figure 1 Gel electrophoresis of expression of ABCG2 protein in PBMCs in AGA subgroup，IGA subgroup and HC group by Western blotting

NUA亚组、HUA亚组、HC组PBMCs ABCG2表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中HUA亚组PBMCs ABCG2表达水平高于NUA亚组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HC组PBMCs ABCG2表达水平低于HUA亚组，差异有统计学意义（P＜0.05）；NUA亚组与HC组PBMCs ABCG2表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表6、图2）。

表6 NUA亚组、HUA亚组、HC组PBMCs ABCG2表达水平比较（±s）Table 6 Expression of ABCG2 protein in PBMCs in NUA subgroup，HUA subgroup and HC group

表6 NUA亚组、HUA亚组、HC组PBMCs ABCG2表达水平比较（±s）Table 6 Expression of ABCG2 protein in PBMCs in NUA subgroup，HUA subgroup and HC group

注：与NUA亚组比较，aP＜0.05；与HUA亚组比较，bP＜0.05

组别 例数 ABCG2 NUA亚组 31 0.43±0.15 HUA亚组 51 0.72±0.26a HC组 46 0.48±0.14b F值 6.319 P值 0.006

图2 Western blotting 法检测NUA亚组、HUA亚组、HC组PBMCs ABCG2 表达水平的凝胶电泳图Figure 2 Gel electrophoresis of expression of ABCG2 protein in PBMCs in NUA subgroup，HUA subgroup and HC group by Western blotting

2.3 ABCG2 mRNA表达水平与血尿酸水平、肌酐水平、Cys-C水平、ESR、hs-CRP水平的相关性分析男性原发性痛风性关节炎患者血尿酸水平、肌酐水平、Cys-C水平、ESR、hs-CRP水平分别为（484.4±130.8）μmol/L、（84.8±20.3）μmol/L、0.8（0.3）mg/L、（21.3±16.6）mm/1 h和 5.6（15.8）mg/L。相关性分析结果显示，男性原发性痛风性关节炎患者PBMCs ABCG2 mRNA表达水平与血尿酸水平呈正相关（r=0.235，P=0.033），与肌酐水平、Cys-C水平呈负相关（r值分别为-0.227、-0.229，P值分别为0.044、0.043），与ESR、hs-CRP水平无直线相关关系（r值分别为-0.181、0.027，P值分别为0.112、0.824）。

3 讨论

20世纪90年代 DOYLE等［8］首次发现 ABCG2，该蛋白由ABCG2基因编码，定位于4q22.1，基因ID：9429，由655个氨基酸构成，蛋白分子量为72 kDA。ABCG2是一种定位于细胞膜的跨膜转运蛋白，目前已经发现其在肾脏近端肾小管上皮的顶膜（刷状缘），小肠、大肠的黏膜上皮细胞、肝细胞等多种组织细胞中均有表达［9-10］。ABCG2已知的功能主要有2种：（1）限制化疗药物［11］、免疫抑制剂［12］、抗病毒药物［13］向靶向细胞内转运，导致多药耐药；（2）参与生理屏障（血-脑脊液［14］、血-胎盘［15］、血生精小管屏障［16］）保护作用。

近年来研究又证实ABCG2还参与了尿酸的外排转运，其中WOODWARD等［3］对表达人ABCG2的非洲爪蟾卵母细胞进行尿酸清除率的计算，发现细胞内尿酸盐含量下降达75%，可见ABCG2的尿酸转运能力极强，是一种高容量尿酸转运蛋白。另外HOSOMI等［5］及ICHIDA等［6］的研究也证实ABCG2有转运尿酸的能力。其中HOSOMI等［5］通过计算高尿酸血症小鼠模型体内肾脏、肠道和肝脏等部位的尿酸清除效率，发现肾脏及肠道均是尿酸的排泄器官。而ICHIDA等［6］也发现在加入三磷酸腺苷（ATP）的高尿酸血症模型组小鼠中ABCG2表达水平明显升高，尿酸排泄能力明显高于未加入ATP的高尿酸血症模型组小鼠。

ABCG2表达于全身多个组织器官，但PBMCs中是否同样有ABCG2表达并参与尿酸转运尚未发现相关报道。基于以上思路，本课题组选取男性原发性痛风性关节炎患者及健康体检者进行分析，发现GA组PBMCs ABCG2 mRNA表达水平高于HC组，进一步亚组分析发现，IGA亚组PBMCs ABCG2 mRNA及蛋白表达水平均高于AGA亚组和HC组，而AGA亚组与HC组间的PBMCs ABCG2 mRNA及蛋白表达水平无差异。以上结果首先得出了ABCG2在PBMCs中表达，其次进一步按照炎症状态分组（AGA、IGA亚组）并未发现在炎症状态最重的急性期（AGA亚组）出现ABCG2高表达，反而是炎性消退的间歇期（IGA）出现了ABCG2高表达。相关性分析结果显示，患者PBMCs ABCG2 mRNA表达水平与炎症指标ESR、hs-CRP水平并无直线相关关系。而痛风经典的炎症过程是单核细胞等炎性细胞在吞噬尿酸盐晶体后激活Toll样受体及NOD样受体介导的免疫炎性信号通路，释放白介素（IL）-1β等炎性因子而引起的炎症瀑布反应［17］。ABCG2并不参与这两条炎性通路中的任何一条，且国内外相关文献也未见ABCG2参与痛风炎症的相关报道。综上，ABCG2可能并不参与痛风的炎症过程。

尿酸是小分子物质，进入PBMCs内的尿酸如何向外周血中转运值得探究。为此，本研究将GA组患者按照尿酸水平分为NUA亚组、HUA亚组进行研究。发现HUA亚组PBMCs ABCG2 mRNA及蛋白表达水平高于NUA亚组和HC组，而NUA亚组和HC组间PBMCs ABCG2 mRNA及蛋白表达水平无差异；PBMCs ABCG2 mRNA表达水平与血尿酸水平呈正相关。可见在PBMCs中表达的ABCG2参与了尿酸向外周血转运的过程，转运到PBMCs外的尿酸通过血液循环进入肾脏等组织而排出体外。PBMCs ABCG2 mRNA表达水平与肌酐、Cys-C水平呈负相关；提示血尿酸水平可能下调了存在肾功能损害的痛风患者PBMCs ABCG2的表达。推测出现上述情况可能是为了避免肾脏进一步损害，限制PBMCs中表达的ABCG2将尿酸向外周血转运，达到减轻肾脏负担的作用。但这个结论目前只是初步推测，还需后期实验进一步证实。

本研究尚存在一定不足之处，主要是未能同时加入痛风患者关节液进行对比分析，后期实验可以增加相关内容，并通过基因敲除体外细胞实验进一步研究ABCG2在PBMCs中的作用机制。而由于PBMCs易在外周血中获取，如果能通过获取痛风或高尿酸血症患者血液而快速检测包括ABCG2在内的尿酸转运蛋白的表达是否异常，不仅有利于寻找痛风发生的分子生物学机制，还能为原发性痛风患者的靶向治疗提供实验室。

综上所述，ABCG2在PBMCs中表达并参与尿酸的转运，未发现与原发性痛风性关节炎的炎症过程相关；PBMCs ABCG2 mRNA与肌酐、Cys-C呈负相关，提示存在肾功能异常的痛风患者可能会下调ABCG2在PBMCs中的表达，这可能有利于肾脏的保护，但其具体机制还需进一步研究。