豆粕发酵物改善小鼠睡眠功效及其与天麻的协同作用

王禹程 马海乐 杨 雪 黄姗芬 黄 畅 李云亮*

（1 江苏大学食品与生物工程学院 江苏镇江212013 2 国家农产品加工技术装备研发分中心 江苏镇江212013）

大豆粕是大豆提取油料后的副产品[1-2]，其蛋白含量丰富，高达30%～50%，其氨基酸组成合理、平衡，各种必需氨基酸的含量均较高，尤其是赖氨酸、色氨酸和苏氨酸[3-4]。近年来，我国每年压榨豆油所用大豆约4 000 万t，由此产生了大量的豆粕，这些豆粕除少部分用于发酵酱油，生产浓缩蛋白和分离蛋白，大部分用于制作动物饲料，然而这些利用方式，许多潜在的活性物质未被有效利用，造成优质蛋白资源的浪费[5]。有研究表明，微生物发酵法制备的大豆粕发酵物具有很多生物学功效，例如抗氧化[6-9]，降血压[10-11]，增强免疫力[12-14]，提高机体生长性能[15]，调节肠道功能及保证肠道组织结构正常[16-17]等，用该方法制备大豆粕发酵物是对大豆粕有效利用的一种方式。目前有研究表明一些植物经微生物发酵后能有效改善睡眠[18-19]，而大豆粕发酵物改善睡眠方面的研究还鲜见报道。

天麻为兰科多年寄生植物，其干燥块根是我国贵重中药，主产于云南、四川、陕西及贵州等地。早在2 000年前《神农本草经》就记载了天麻的功效，天麻具有平肝息风止痉之功效[20-21]。随着研究的深入，天麻的镇静、促眠作用被大量试验证实[22-23]，其能够影响大鼠丘脑、脑干、皮层等脑结构，释放多巴胺和去甲肾上腺素，天麻素能使正常成人脑电图中的α 波出现睡眠波形。目前豆粕发酵物与天麻的混合物在改善睡眠功效方面的研究尚为空白。

本文研究了豆粕发酵物及其与天麻的混合物对改善小鼠睡眠功效的影响，为大豆粕高值化利用开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

材料：大豆粕（粉碎过60 目筛），中储粮镇江粮油有限公司提供；天麻（粉碎过60 目筛），亳州市胜元堂中药材有限公司；巴比妥钠、 戊巴比妥钠，中国医药（集团）上海化学试剂公司。

1.2 试验设备

TK-600A 手提万能打粉机，长沙市通康机电有限公司；IS-RDD3 摇床，上海福玛试验设备有限公司；SW-CJ-2FD 超净工作台，苏州净化设备有限公司。

1.3 发酵菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）10160，江苏大学食品与生物工程学院保藏。

1.4 试验方法

1.4.1 大豆粕枯草芽孢杆菌发酵物的制备 大豆粕发酵物的制备参考罗娟的方法[24]，并略作修改。

豆粕发酵培养条件：20%豆粕，2%玉米黄粉，1% KH2PO4，10%枯草芽孢杆菌菌种接种量（V/V），培养温度35 ℃，发酵3 d。将发酵后的豆粕发酵物通过热风干燥，再粉碎过60 目筛得豆粕发酵物粉末，干燥保存备用。

1.4.2 改善睡眠动物试验 试验选用400 只健康雄性ICR 小鼠，体重为20 g±2 g，由江苏大学动物饲养中心提供，许可证编号：SCXK （苏）2013-0011，动物试验室许可证编号：SYXK （苏）2013-0036。

试验小鼠随机选取80 只分4 组，每组20 只用于急性毒性试验，其余320 只随机分成4 批，每批分4 组，第1 组为对照组（control），第2 组为豆粕发酵物组 （soybean meal fermented product，SMFP），第3 组为天麻组（gastrodiae），第4 组为混合组（mixture，豆粕发酵物粉末与天麻粉末按质量比1∶1 配制），每组20 只，第2 组、第3 组和第4组分别以2.5 g/kg BW·d 剂量灌胃豆粕发酵物、天麻和豆粕发酵物-天麻混合物溶液，对照组灌胃等体积蒸馏水。320 只小鼠连续灌胃14 d 后开展直接睡眠试验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验、巴比妥钠睡眠潜伏期试验和延长戊巴比妥钠睡眠时间试验。试验在25 ℃±2 ℃安静环境下进行。

1.4.3 急性毒性试验 最大耐受剂量法：80 只小鼠随机均分成4 组，其中3 组以睡眠试验10 倍剂量即25 g/kg BW（平均分3 次灌，每次间隔6 h 以上）分别灌胃豆粕发酵物、 天麻粉末和豆粕发酵物-天麻混合物，1 组灌胃等剂量蒸馏水作为对照。连续观察7 d，观察80 只小鼠中毒症状及死亡情况。

1.4.4 直接睡眠试验 3 组小鼠以2.5 g/kg BW剂量分别一次性灌胃的豆粕发酵物、天麻、豆粕发酵物-天麻混合物，对照组给予等体积蒸馏水，观察动物是否出现睡眠现象。睡眠以翻正反射消失为指标。当小鼠置于背卧位时，会立即翻正身位，如超过60 s 不能翻正者，即认为翻正反射消失，进入睡眠。翻正反射恢复即为动物觉醒，翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间，记录1 h 内4个组中入睡动物数及睡眠时间，观察各受试物是否有直接诱导睡眠作用。

1.4.5 戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验 各组小鼠末次灌胃各组受试物30 min 后，按预试验确定的戊巴比妥钠最大阈下催眠剂量30 mg/kg·BW（80%～90%小鼠翻正反射不消失的剂量）对两组小鼠腹腔注射，记录30 min 内入睡动物数量（翻正反射消失达1 min 以上者）。

1.4.6 巴比妥钠睡眠潜伏期试验 各组小鼠末次灌胃各组受试物30 min 后，按250 mg/kg·BW 剂量腹腔注射巴比妥钠，从注射开始到翻正反射消失所用时间为睡眠潜伏期，记录各组小鼠睡眠潜伏期。

1.4.7 延长戊巴比妥钠睡眠时间试验 各组小鼠末次灌胃各组受试物30 min 后，按50 mg/kg BW腹腔注射戊巴比妥钠，以翻正反射消失和翻正反射恢复为指标，两者之间这段时间为睡眠时间。

1.4.8 小鼠脏器指数 小鼠脏器指数计算公式如式（1）：

1.5 统计学处理

试验结果以SPSS 17.0 软件进行统计学分析，试验数据用±s 表示，采用One Way-ANOVA 检验，差异显著水平为P<0.05，差异极显著水平为P<0.01。直接睡眠试验和戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验以入睡动物为计数资料，经χ2检验，差异显著水平为P<0.05，差异极显著水平为P<0.01。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验

80 只小鼠均按睡眠试验10 倍剂量即25 g/kg·BW 灌胃各组受试物，平均分3 次灌胃，每次间隔6 h 以上，连续观察7 d。80 只小鼠没有死亡，均能自由活动，没有任何中毒症状出现。说明所用豆粕发酵物、天麻粉末、豆粕发酵物-天麻混合物按总剂量25 g/kg·BW 灌胃对小鼠没有毒性，小鼠对这3 种受试物最大耐受剂量均大于25 g/kg·BW。

2.2 直接睡眠试验结果

各组直接睡眠试验睡眠动物数见表1，结果表明1 h 内4 个组小鼠均没有睡眠，经χ2检验，3组间没有显著性差异（P＞0.05）。说明豆粕发酵物、天麻粉末及两者混合物对小鼠都没有直接催眠作用，符合《保健食品检验与评价技术规范实施手册》[25]中改善睡眠保健食品的要求，可进行接下来的戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验、 巴比妥钠睡眠潜伏期试验和延长戊巴比妥钠睡眠时间试验。

表1 直接睡眠试验睡眠动物数Table 1 Slept number of mice in directly sleeping test

2.3 戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验结果

戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验30 min 内睡眠动物数见表2，结果经χ2检验，其他3 组与对照组之间均有显著性差异（P＜0.01）。表明豆粕发酵物、 天麻粉末及两者混合物均具有显著提高小鼠睡眠率的作用。以豆粕发酵物-天麻混合物提高小鼠睡眠率的效果最优，高于豆粕发酵物组和天麻组，说明豆粕发酵物与天麻混合物有协同提高小鼠睡眠率的作用。

表2 戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验30 min 内睡眠动物数Tabel 2 Slept number of mice in 30 min in subthreshold dose of pentobarbital sodium hypnotic experiments

2.4 巴比妥钠睡眠潜伏期试验结果

对豆粕发酵物、 天麻粉末以及两者混合物进行巴比妥钠睡眠潜伏期试验，研究3 种受试物协同巴比妥钠对小鼠入睡时间的影响。结果如图1，对照组、豆粕发酵物组、天麻组和混合组的小鼠睡眠潜伏期时间分别为358 s ± 86 s、322 s ± 77 s、268 s±63 s 和225 s±51 s，经One Way-ANOVA检验，发现豆粕发酵物组相比于对照组没有显著性差异（P＞0.05）；但天麻组和混合组所用入睡时间相比于对照组和豆粕发酵物组均有显著性差异（P＜0.05），且混合组所用入睡时间显著低于天麻组（P＜0.05），这说明豆粕发酵物并没有缩短小鼠入睡时间的作用，但是天麻粉末以及豆粕发酵物与天麻的混合物却表现出显著缩短小鼠入睡时间的功效，其中以豆粕发酵物-天麻混合物缩短小鼠睡眠潜伏期的效果最好，说明豆粕发酵物与天麻具有协同缩短小鼠睡眠潜伏期的功效。

2.5 延长戊巴比妥钠睡眠时间试验结果

对豆粕发酵物、 天麻粉末以及两者混合物进行延长戊巴比妥钠睡眠时间试验，研究3 种受试物协同戊巴比妥钠对延长小鼠睡眠时间的影响。结果如图2所示，对照组、豆粕发酵物组、天麻组和混合组小鼠睡眠时间分别为1 642 s ± 203 s、2837 s±263 s、1842 s±241 s 和3419 s±218 s，经One Way-ANOVA 检验，发现天麻组与对照组相比没有显著性差异（P＞0.05），豆粕发酵物组与对照组相比有显著差异（P＜0.05），混合物组与对照组相比有极显著差异（P＜0.01）。而混合组小鼠睡眠时间与豆粕发酵物组相比也有显著增加（P＜0.05），与天麻组相比极显著增加（P＜0.01）。说明天麻粉末没有明显延长小鼠睡眠时间的作用，而豆粕发酵物及其与天麻的混合物有显著延长小鼠睡眠时间的功效。其中以豆粕发酵物-天麻混合物的延长效果最优，说明豆粕发酵物有与天麻显著协同延长小鼠睡眠时间的功效。

2.6 受试物对小鼠体重的影响

小鼠体重在一定程度上能反映小鼠的生长状况。自灌胃开始到灌胃14 d 结束，每3 天记录一次各组小鼠体重，绘制成小鼠体重变化趋势图见图3。经One Way-ANOVA 检验，4 组小鼠体重始终没有显著性差异（P＞0.05）。说明按2.5 g/kg BWod 剂量灌胃豆粕发酵物、天麻粉末以及两者混合物对小鼠生长状况没有明显的影响。

2.7 受试物对小鼠脏器指数的影响

脏器指数在一定程度上能反映小鼠的生理健康状况。试验结束后，解剖各组小鼠，分别取出肝脏、脾脏、肾脏、胃，并称重记录，根据1.4.9 节中式（1）计算脏器指数。小鼠脏器指数结果如图4，4 种脏器分别经One Way-ANOVA 检验，4 组小鼠4种脏器间均没有显著性差异（P＞0.05）。说明按2.5 g/kg·BW·d 剂量灌胃豆粕发酵物、 天麻粉末以及两者混合物对小鼠肝脏、脾脏、肾脏、胃4 种脏器健康状况均没有明显的影响。

图1 巴比妥钠睡眠潜伏期试验Fig.1 Barbital sodium sleep latency experiment

图2 延长戊巴比妥钠睡眠时间试验Fig.2 Prolonged pentobarbital sodium sleep time experiment

图3 小鼠体重变化趋势Fig.3 Changing trend of mice’s body weight

3 结论与讨论

图4 小鼠脏器指数Fig.4 Mice’s organ index

本文通过直接睡眠试验、 戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验、 巴比妥钠睡眠潜伏期试验和延长戊巴比妥钠睡眠时间试验，研究豆粕发酵物以及豆粕发酵延长戊巴比妥钠睡眠时间试验，研究豆粕发酵物、 天麻粉末以及两者混合物对改善小鼠睡眠功效的影响。结果表明直接灌胃2.5 g/kg BW·d剂量的豆粕发酵物、 天麻粉末以及两者混合物均没有直接催眠小鼠的作用（P＞0.05），灌胃14 d 后，以上3 种受试物均能协同阈下剂量戊巴比妥钠增加小鼠入睡率（P＜0.05），但单一灌胃天麻并没有协同戊巴比妥钠延长小鼠睡眠时间（P＜0.05）的作用，这与齐丽娟等[26]的研究结果一致。而在协同巴比妥钠缩短小鼠睡眠潜伏期的作用方面，单一的豆粕发酵物并没有明显效果。根据《保健食品检验与评价技术规范实施手册》[25]，受试物在戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验、 巴比妥钠睡眠潜伏期试验和延长戊巴比妥钠睡眠时间试验3 项试验中两项有显著效果，则说明豆粕发酵物、天麻以及豆粕发酵物-天麻混合物均具有改善睡眠的功效，其中豆粕发酵物与天麻的混合物改善睡眠的效果最为显著，优于豆粕发酵物和天麻单独作用时的效果。以上结果说明豆粕发酵物具有改善小鼠睡眠功效，并与天麻具有协同作用。《本草衍义》中有记载“天麻须别药相佐使，然后见其功。”古今医家单独使用天麻很少见，重在配伍使用方显殊功[27]。本文使用豆粕发酵物与天麻混合使用在改善睡眠上具有协同效果，与古医书用药经验相一致，豆粕发酵物-天麻混合物的效果确实比两种配方单独使用效果更优。

经过统计4 组小鼠体重和脏器指数发现，均没有显著差异，说明以2.5 g/kg BW·d 剂量给小鼠灌胃豆粕发酵物、天麻以及豆粕发酵物-天麻混合物没有毒性作用，对小鼠整体和脏器的生长健康状况没有明显影响。

目前研究缺少豆粕枯草芽孢杆菌发酵物的毒性相关研究，不清楚其毒理效应，另一方面是早有研究表明天麻如果使用过量，具有毒性[22]。因此在改善睡眠试验之前先对豆粕发酵物、 天麻以及豆粕发酵物-天麻混合物这3 种受试物进行最大耐受剂量毒理学试验，试验结果表明，3 种受试物的最大耐受剂量均大于25 g/kg BW。

豆粕发酵物改善睡眠的研究较少，本文初步研究了豆粕发酵物、天麻以及豆粕发酵物-天麻混合物在协同戊巴比妥钠、 巴比妥钠改善睡眠方面的具体效果，为豆粕发酵物在改善睡眠方面的深入研究及大豆粕的高值化利用打下了基础。在本文中只研究了豆粕发酵物与天麻等比例混合物的促进睡眠的效果，它们之间最佳剂量及其配比将在后续的试验中进一步优化。