糖基化酰基血红蛋白与甜菜粉对中式香肠品质的影响

肖朝耿 谭芦兰 朱培培 杨慧娟 谌 迪 卢文静 任发政 郭慧媛葛升源 唐宏刚 陈黎洪*

（1 浙江省农业科学院 食品科学研究所 杭州310021 2 中国农业大学 食品科学与营养工程学院 北京100083 3 浙江华统肉制品股份有限公司 浙江义乌322005）

中式香肠是指以肉类为原料，经斩拌后加入食盐、白糖和亚硝酸盐等辅料，腌制后灌入动物肠衣经烘烤或自然晾晒而制成的中国特色肉制品，是中国肉类制品中品种最多的一大类产品[1]。在香肠的腌制过程中，常加入亚硝酸盐作为发色剂，亚硝酸盐在腌肉制品中具有重要作用。根据GB2760-2014 国家标准规定，肉品腌渍时可以添加硝酸盐或亚硝酸盐作为发色剂，其具有发色、抗氧化和抑菌等作用，然而亚硝酸盐在体内可与特定生物胺发生反应，生成亚硝胺[2]，具有一定的致癌性。为避免这种潜在危险，世界各国的研究者开始寻找新的食品着色剂以及可以替代亚硝酸盐的天然物质。

血液中的血红蛋白（Hb）与亚硝基NO-有较强的结合力。Hb 与亚硝酸钠先反应生成亚硝基血红蛋白（HbNO），制成粉后用于肉制品中，使肉制品呈鲜红色[3]。由于亚硝基血红蛋白在光照条件下不稳定，易发生分解和褪色[4]，所以有研究采取微胶囊包埋法获得稳定的亚硝基血红蛋白，然而包埋后的亚硝基血红蛋白分散性较差[5]。为了提高血红蛋白类色素的稳定性和分散性，利用蛋白质和多糖之间的美拉德反应生成多糖-蛋白质共价复合物，这种复合物具有较好的热稳定性和分散性等功能特性[6]，因此对血红蛋白采取糖基化反应以获得理想品质的血红蛋白类色素。

红叶甜菜 （Beta vulgaris L.var.cicla L.）为藜科甜菜属多年生草本观叶植物，原产欧洲，目前我国已成功引种。甜菜红素是取代合成红色素最理想的天然红色素之一，不同于可能引起人类副作用的合成着色剂[7]，其可广泛应用于饮料、食品、医药及化妆品等领域，是化学合成红色素最佳替代品之一，除作为天然着色剂外，还具有抗氧化，抗癌，降血脂和抑菌等作用，对人类健康有积极影响，因此具有很好的开发价值[8]。目前国内甜菜的研究多集中在甜菜色素的稳定性及其提取条件上，对于甜菜粉加入香肠中用于替代亚硝酸钠的研究较少。

本试验中利用甜菜红色素的着色作用及其本身含有的硝酸盐与糖基化酰基血红蛋白复配后添加于肉制品中，旨在使肉制品产生良好的发色效果，并降低其亚硝酸盐残留量，提高中式肉制品的安全性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糖基化酰基血红蛋白粉、 甜菜粉，实验室自制；猪肉、肠衣，杭州市德胜农贸市场；食盐、蔗糖，杭州市江干区华润万家超市。以上材料均符合食品原料、配料的要求。

柠檬酸三钠、 甘油、 烟酰胺、D-异抗坏血酸钠、水溶性壳聚糖、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、氢氧化钠、饱和硼砂、亚铁氰化钾、乙酸锌、丙酮、盐酸、三氯乙酸、三氯甲烷、硫代巴比妥酸、酚酞等，国药集团化学试剂有限公司，所有试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

Tensor 27 傅里叶中红外光谱仪，德国布鲁克光谱仪器公司；真空包装机、灭菌锅、UV-1800 紫外可见分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司；FE20 型pH 计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；ALB-224 型电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DHG-9146A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；Color Quest XE 色差仪，上海信联创作电子有限公司；Themo scientific 冷冻离心机，美国赛默飞公司；TA.XT Plus 质构仪，英国SMS 公司；CM-21 斩拌机，北京希恩机械设备有限公司；GC-8L 灌肠机，肇庆市鼎湖景晟机械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 糖基化酰基血红蛋白的制备 猪血采集后加入0.5%柠檬酸三钠做抗凝处理，8 层纱布过滤除去杂质，静置8 h。4 000 r/min 离心15 min 后滤去上清液，加等量蒸馏水充分搅拌3 h 使血细胞破壁，释放出血红蛋白[10]。血红蛋白液中加入10 mg/mL 甘油，充分搅拌。然后分别加入质量分数1%烟酰胺和1% D-异抗坏血酸钠，搅拌均匀后调节pH 值为7.3～7.5，置于4 ℃冰箱避光反应24 h[11]。上述制备的酰基化血红蛋白液与初始质量分数为0.5%水溶性壳聚糖液按体积比为1∶1 混合，再调pH 值为7.0 左右[12]。在50 ℃条件下加热5 min，过滤去除未反应、变性的蛋白质，取滤液于棕色瓶中备用[13]。将包裹保鲜膜的备用液放置于-80 ℃冰箱中，冷冻过夜，于真空冷冻干燥机冷阱温度为-40℃时，放入冷冻备用液，冷冻约48 h，直至冻干。

1.3.2 糖基化酰基血红蛋白复合甜菜粉添加量的筛选 0.04%，0.06%，0.08%糖基化酰基血红蛋白复合0.1%，0.3%，0.5%甜菜粉，添加于中式香肠中，并设空白和100 mg/kg 亚硝酸钠组。对中式香肠做两种处理，分别为真空包装后高温加热（121℃，30 min）处理和常温香肠。分别测定色差值。

1.3.3 糖基化酰基血红蛋白与甜菜粉对中式香肠品质的影响

1.3.3.1 吸光度 将制备的糖基化酰基血红蛋白液先在75 ℃加热10 min，过滤除去未反应的酰基化血红蛋白，再95 ℃加热10 min，除去变性沉淀的成分后于540 nm 波长处测定其吸光值[13]。

1.3.3.2 中红外扫描 将血红蛋白标准品制备成5%酰基化血红蛋白、10%酰基化血红蛋白；5%糖基化酰基血红蛋白和10%糖基化酰基血红蛋白，再分别将酰基化血红蛋白和糖基化酰基血红蛋白的冻干粉以嗅化钾压片，测定红外吸收光谱。

1.3.3.3 亚硝酸盐含量的测定 参照GB 500933-2010[14]，采用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐。试样经沉淀蛋白质，除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，于波长538 nm 处测得亚硝酸盐含量。

1.3.3.4 色差值的测定 采用Color Quest XE 色差仪测定L*、a*、b*值[15]。L*值越大说明亮度越高，a*值越大说明颜色越红。分别测定贮存2，7，14 d时生香肠的L*、a*、b*值，每组测定3 次。

1.3.3.5 亚硝基色素和总色素的测定 采用Hornsey[16]的方法，对贮存2，7，14 d 的中式香肠进行亚硝基肌红蛋白（NOMb）和总色素的测定。

亚硝基色素分析：称取5 g 样品置于棕色瓶中，加入20 mL 丙酮、1.5 mL 蒸馏水搅拌5 min，混合物用滤纸过滤，立即在540 nm 波长处测其吸光度值A1。NOMb 含量=A1×290，每组测定3 次。

总色素分析：称取5 g 样品置于棕色瓶中，加入20 mL 丙酮、1 mL 蒸馏水和0.5 mL 盐酸，将混合物于暗处放置1 h 提取色素。过滤后在640 nm处测定A2。总色素含量=A2×680，每组测定3 次。

NOMb 含量作为总色素的一部分，计算公式如下：

1.3.3.6 TBARS 值的测定 参考Liza[17]的方法，取5 g 切碎的猪肉灌肠样品，加25 mL 储备液（0.375%硫代巴比妥酸和15%三氯乙酸溶于0.25 mol/L 盐酸），沸水浴10 min 后立即用流水冷却，加2 mL 三氯甲烷，混匀，在5 000 r/min，4 ℃条件下离心10 min，取上清液，在λ=532 nm 条件下测其吸光度A，每组测定3 次。TBARS 值以每千克脂质氧化样品溶液中丙二醛的毫克数表示。计算公式如下：

式中，2.77——10 g 样品校正因子。

1.3.3.7 pH 值 取10 g 香肠样品，用剪刀剪碎后，加100 mL 蒸馏水，4 000 r/min 离心10 min，过滤后，取上清液用酸度仪测定[18]。酸度仪在使用前用标准液（pH 4 和pH 7）校准，每组测定3 次。

1.3.3.8 酸度 取上述滤液50 mL，以酚酞为指示剂，用0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定至粉红色，15 s 内粉红色不褪去，记下NaOH 消耗的毫升数[19]，每组测定2 次。计算公式如下：

式 中，c——NaOH 浓 度（mol/L）；v——NaOH消耗体积 （mL）；v0——样品稀释液总体积（mL）；v1——测定用样液体积（mL）；k——0.09 为每毫摩尔乳酸的克数。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 糖基化酰基血红蛋白复合甜菜粉添加量的筛选

由表1所示，0.06%糖基化酰基血红蛋白+0.1%甜菜粉组亮度L*值与0.08%糖基化酰基血红蛋白+0.1%甜菜粉组亮度值无显著差异（P＞0.05），同时两试验组均与亚硝酸钠组无显著差异（P＞0.05），说明甜菜粉添加量为0.1%时，与0.06%，0.08%糖基化酰基血红蛋白复合其产生的亮度值与亚硝酸钠组无差异。

试验组中0.08%糖基化酰基血红蛋白+0.1%甜菜粉组a*值小于亚硝酸钠组（P＜0.05），糖基化酰基血红蛋白添加量为0.06%，各添加量的甜菜粉组之间a*值无显著差异（P＞0.05）。亚硝酸钠组的b*值与0.06%糖基化酰基血红蛋白+0.1%甜菜粉组之间无显著差异（P＞0.05），而0.08%糖基化酰基血红蛋白+0.5%甜菜粉组b*值显著大于各试验组和对照组。

表1 生香肠色差值Table1 The color of raw sausages

中式香肠的生成过程中，a*值大，色泽理想，而b*值越大则对香肠色泽产生不利影响。综合亮度值L*、a*、b*值，试验组中0.08%糖基化酰基血红蛋白+0.1%甜菜粉组色泽最佳，0.06%糖基化酰基血红蛋白+0.1%甜菜粉组次之。

由表2可知，高温加热试验对9 组试验组和2 组对照组色差值均产生了不利影响。空白组亮度值增大，且显著大于试验组和亚硝酸钠组（P＜0.05），亚硝酸钠组亮度L*值与0.06%糖基化酰基血红蛋白+0.1%甜菜粉组无显著差异（P＞0.05）。甜菜粉添加量为0.1%时，0.04%，0.06%和0.08%糖基化酰基血红蛋白组的a*值无显著差异（P＞0.05），同时与0.03%甜菜粉+0.06%糖基化酰基血红蛋白组、0.03%甜菜粉+0.08%糖基化酰基血红蛋白无显著差异（P＞0.05）。而9 组试验组随甜菜粉添加量的增加，b*值呈增大趋势。结合L*、a*、b*值，在高温加热试验中，甜菜粉添加量为0.1%时，试验组香肠有较为理想的色泽。

表2 高温肠色差值Table2 The color of high temperature sausages

为进一步验证糖基化酰基血红蛋白的最佳添加量，0.1%甜菜粉分别与0.04%，0.06%，0.08%糖基化酰基血红蛋白结合，同时设立空白组和亚硝酸钠组。

2.2 吸光度

由表3可知，酰基血红蛋白与壳聚糖的混合液在75 ℃加热后，由于部分蛋白质变性沉淀，吸光度有所下降。75 ℃加热后，酰基血红蛋白全部发生热变性。95 ℃加热后，过滤去除不溶物，吸光度再次下降。糖基化酰基血红蛋白，糖基化程度与其热稳定性是一致的，因此可以通过选择性加热，纯化糖基化酰基血红蛋白[20]。

表3 温度对反应液吸光度的影响Table3 The effect of temperature on absorbance of the solution

2.3 中红外扫描

分别对5%血红蛋白液、酰基化反应及糖基化反应和10%血红蛋白液、 酰基化反应和糖基化反应的冻干粉，分别在600～4 000 cm-1波段进行透射扫描。中红外吸收光谱可以反应出化合物官能团的特征吸收峰及变化，进一步揭示反应机理。结果如表4所示。中红外扫描光谱图如图1和图2所示。

表4 血红蛋白的中红外吸收Table4 The mid-infrared absorption of Hb

由图1可知，在1 660～1 540 cm-1之间有两个亚胺吸收峰，中红外光谱表明发生了羰氨反应，形成共价结合。

根据吸收峰所处波段可以判定猪血红蛋白经过酰基化及糖基化处理，均发生了相应的反应；根据峰面积，可以判定10%猪血红蛋白经过酰基化、糖基化处理后峰面积大于5%猪血红蛋白峰面积。猪血中约含有10%血红蛋白，经反应处理后形成稳定的共价复合物。

图1 C=O 吸收峰Fig.1 The absorption peak of C=O

图2 C=H 键吸收峰Fig.2 The absorption peak of C=H

2.4 糖基化酰基血红蛋白与甜菜粉对中式香肠色差的影响

由表5可知，在整个贮藏期间，空白组亮度值显著高于试验组和亚硝酸钠组（P＜0.05）。在贮藏2，7 d 时，亚硝酸钠组亮度L*值与3 个试验组均差异不显著（P＞0.05）；在第14 天，亚硝酸钠组与0.04%糖基化酰基血红蛋白组无显著性差异（P＞0.05），0.06%，0.08%糖基化酰基血红蛋白组的L*无显著差异（P＞0.05）。试验组糖基化酰基血红蛋白添加量为0.04%时，亮度值最佳，添加量为0.06%次之。

在整个贮藏期间，0.06%糖基化酰基血红蛋白组的a*值与亚硝酸钠组无显著性差异（P＞0.05），亚硝酸钠组a*值显著大于0.08%糖基化酰基血红蛋白组（P＜0.05）。在第2 天时，3 个试验组之间b*值无显著差异（P＞0.05）；在第7 天时，3 个试验组之间b*值无显著差异，且0.06%猪血粉组与亚硝酸钠组无显著差异（P＞0.05）；在第14 天时，各处理组之间均无显著差异（P＞0.05）。

综合考虑中式香肠样品的L*值、a*值和b*值，0.06%糖基化酰基血红蛋白添加量优于0.04%和0.08%糖基化酰基血红蛋白添加量，因此0.06%糖基化酰基血红蛋白复合0.1%甜菜粉添加于中式香肠中，产生的色泽最佳。

2.5 糖基化酰基血红蛋白与甜菜粉对中式香肠亚硝酸盐的影响

由表6可知，在整个贮藏期间，亚硝酸钠组的亚硝酸盐残留量显著大于3 组试验组和空白组（P＜0.05）。在贮藏7，14 d 时，0.06%糖基化酰基血红蛋白组的亚硝酸盐残留量显著小于0.04%和0.08%糖基化酰基血红蛋白组。在整个贮藏期间，各组亚硝酸盐残留量远小于国标规定的残留量（≦30 mg/kg）。空白组的亚硝酸盐残留量呈上升趋势，可能因为在中式香肠内部的微生物的作用下，NO 与H+结合生成亚硝酸盐。

2.6 糖基化酰基血红蛋白与甜菜粉对中式香肠NOMb 的影响

在整个贮藏期间，各处理组NOMb 值整体随贮藏时间的延长呈下降趋势。在贮藏2，7 d，3 个试验组与亚硝酸钠组的NOMb 值无显著性差异（P＞0.05）。在第14 天时，亚硝酸钠组的NOMb 值与0.04%糖基化酰基血红蛋白组无显著差异（P＞0.05），且显著大于0.06%和0.08%糖基化酰基血红蛋白组（P＜0.05）。在第14 天，3 个试验组随糖基化酰基血红蛋白添加量增加而减小，原因可能是糖基化酰基血红蛋白与甜菜粉相互作用，导致NOMb 生成量降低。

2.7 糖基化酰基血红蛋白与甜菜粉对中式香肠TBARS 的影响

各处理组TBARS 值随贮藏时间的延长而增大。在第14 天，空白组TBARS 值显著大于3 个试验组和亚硝酸钠组 （P＜0.05），且3 个试验组的TBARS 值显著性大于亚硝酸钠组（P＜0.05）。在第2 天，3 个试验组的TBARS 值差异不显著（P＞0.05）。3 个试验组TBARS 值显著小于空白组，说明糖基化酰基血红蛋白和甜菜粉对中式香肠有一定的抗氧化性，而其抗氧化性低于亚硝酸盐抗氧化效果。

表6 贮存期间各处理组香肠Nitrite、NOMb、TBARS 的变化Table6 Changes of Nitrite，NOMb and TBARS in each treatment group during storage

2.8 糖基化酰基血红蛋白与甜菜粉对中式香肠pH 值和酸度的影响

由表7可知，整个贮藏期间，亚硝酸钠组的pH 值显著大于空白组，且亚硝酸钠组和空白组pH 值显著大于3 个试验组（P＜0.05）；3 个试验组中0.08%糖基化酰基血红蛋白组的pH 值显著小于0.04%和0.06%糖基化酰基血红蛋白组。在第2，14 天，0.06%糖基化酰基血红蛋白组的pH 值显著大于0.04%糖基化酰基血红蛋白组（P＜0.05）。

pH 值是评定肉品品质常用的理化指标之一，可间接反映肉品的微生物特性和感官品质。而酸度是指食品中所有酸性物质的总和，可用来表示食品酸败程度。在整个贮藏期间，3 个试验组中0.06%糖基化酰基血红蛋白组的酸度值显著小于0.04%和0.08%糖基化酰基血红蛋白组；除亚硝酸钠组外各组酸度值呈上升趋势。在第14 天时，空白组、0.04%和0.08%糖基化酰基血红蛋白组3 组之间的酸度值无显著性差异（P＞0.05）。糖基化酰基血红蛋白和甜菜粉复合的抗氧化性小于亚硝酸钠，可加入VC 提高其抗氧化性。

2.9 糖基化酰基血红蛋白与甜菜粉对中式香肠质构的影响

由表8可知，0.08%糖基化酰基血红蛋白组的硬度与亚硝酸钠组无显著性差异（P＞0.05），0.08%糖基化酰基血红蛋白组和亚硝酸钠组硬度与0.04%糖基化酰基血红蛋白组无显著性差异（P＞0.05），并且与空白组和0.06%糖基化酰基血红蛋白组硬度值无显著性差异（P＞0.05）。试验组中0.06%糖基化酰基血红蛋白组的硬度显著小于其它两组（P＜0.05）；5 个处理组香肠的弹性和内聚性均表现不显著；0.06%糖基化酰基血红蛋白组的胶着性与亚硝酸钠组和0.08%糖基化酰基血红蛋白组无显著差异（P>0.05），同时0.06%糖基化酰基血红蛋白组的胶着性与亚硝酸钠组和0.04%糖基化酰基血红蛋白组无显著差异（P>0.05）；空白组的咀嚼性显著性小于亚硝酸钠组和3 个试验组，其中3 个试验组的咀嚼性与亚硝酸钠组无显著差异（P>0.05）。胶着性和咀嚼性是基于硬度的二次特性，三者具有相似的变化规律[21]。本试验的研究结果与该规律相符。甜菜粉和糖基化酰基血红蛋白的添加使香肠的硬度、胶着性和咀嚼性增大，使口感变脆，咀嚼性更好。综上所述，0.06%糖基化酰基血红蛋白对中式香肠的质构起到更好的作用。

表7 贮存期间各处理组香肠pH 值、酸度变化Table7 Changes of pH and acidity in each treatment group during storage

表8 贮存期间各处理组香肠质构的变化Table8 Changes of texture of sausage during storage

3 结论

血液中的血红蛋白糖基化处理后与红叶甜菜粉复配添加于中式香肠中，试验结果表明0.06%糖基化酰基血红蛋白和0.1%甜菜粉复合替代100 mg/kg 亚硝酸钠添加于中式香肠中。

降低中式香肠中的亚硒胺酸盐含量是肉制品加工的研究重点，本次试验从多方面证明了糖基化酰基血红蛋白和甜菜粉复合添加于中式香肠中，不仅能起到降低亚硝酸盐残留的作用，同时还有一定的发色作用，且不影响香肠的弹性和内聚性等质构特性。因此使用糖基化酰基血红蛋白与红叶甜菜粉复配添加于香肠加工中可以有效替代亚硝酸钠，并降低亚硝酸盐的含量。