血清miRNA-130a与HBV相关慢加急性(亚急性)肝衰竭患者预后的相关性分析

薛扬 郭宏强

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是以凝血机制障碍、高胆红素血症、黄疸、腹水、肝性脑病、肝肾综合征以及多脏器功能衰竭等为主要表现的临床症候群[1]。我国90%的ACLF由乙型肝炎病毒(HBV)引发，称为乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic hepatitis B liver failure，ACHBLF)。ACHBLF病死率高，病情凶险，进展迅速，患者普遍预后差[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)能调控转录水平后的基因翻译[3]，其机制为结合信使RNA的3'端非翻译区进行调控，此外胚胎的发育、细胞增殖与分化均与miRNA关系密切。miR-130a在急性心肌炎、类风湿关节炎、肾炎中表达增加，提示miR-130a在炎症反应中发挥重要调控作用。但目前尚无关于miRNA-130a与ACHBLF预后关系的研究报道。因此本研究拟分析血清miR-130a水平与ACHBLF患者预后的相关性，为ACHBLF的早期诊断、临床治疗以及预后效果分析提供理论及实践依据。

资料和方法

一、一般资料

收集2013年7月至2017年6月本院收治ACHBLF患者110例，所有患者行血常规、血生化、尿常规、血清乙型肝炎两对半(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)、血清HBV DNA等常规检查，符合我国2012年《肝衰竭诊治指南》中的诊断标准[4]。 ACHBLF患者按照死亡结局分成生存组54例、死亡组56例，两组在性别、年龄、病程等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，同时匹配本院体检中心健康体检者52名作为对照组。患者及家属签订知情同意书、通过医院伦理委员会审核。

纳入标准：可自由交流和沟通；聚合酶链式反应(PCR)检测血HBV DNA载量升高且肝功能异常；极度乏力，并有明显厌食、呕吐和腹胀等严重消化道症状；腹部肝胆B超及磁共振胰胆管造影排除先天性代谢性疾病、胆道闭锁及其他原因所致的肝炎；未出现肝性脑病或明显腹水；ALT持续或反复异常，或肝组织学检查有肝炎病变。

排除标准：人类免疫缺陷病毒感染者、丁型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝病、胆汁淤积性肝病、自身免疫性肝病患者、各种急慢性感染的患者，以及恶性肿瘤患者；其他病因引起的免疫复合物肾炎。

二、研究方法

(一)主要仪器及试剂

Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒(碧云天生物技术公司产品)、miRNA-130a基因的表达测定采用UltraSYBR One Step RNA PCR Kit(宝生物工程大连有限公司)、实时荧光定量PCR仪(美国热电公司)、NanoDrop2000c 型蛋白核酸检测仪(美国Thermo公司)、超净工作台(上海恒跃医疗器械有限公司)。

(二)血清miRNA-130a mRNA表达水平测定

患者清晨空腹静脉抽血10 ml，置于普通无菌采血管中，3 000 r/min离心10 min，收集上清液，用于测定miRNA-130a mRNA表达水平。参照GenBank 数据获取 2 个基因多态性位点的序列，设计待测基因位点的PCR 扩增引物和单碱基延伸引物，按20 μL模板和 50 μL反应液构成 PCR反应体系， 扩增程序: 96 ℃ 6 min， 94 ℃ 15 s，65 ℃ 45 s，重复 60个循环，采集荧光。实时荧光定量 PCR仪检测其表达量。

三、 统计学方法

结 果

一、三组一般情况比较

生存组、死亡组在性别、年龄、病程、Alb、ALT、AST、HBV DNA、TBil等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)；生存组、死亡组ALT、AST、TBil水平高于对照组，Alb水平低于对照组(P<0.05)。

二、对照组、ACHBLF组miRNA-130a mRNA表达水平比较

ACHBLF组miRNA-130a mRNA表达水平明显高于对照组(1.98±0.68对0.67±0.14)(t=19.357，P<0.05)。

三、生存组、死亡组miRNA-130a、MELD评分、PT、PTA、APTT、INR比较

生存组miRNA-130a表达水平、APTT高于死亡组，MELD评分、PT、PTA、INR低于死亡组(t=12.127、10.712、14.413、8.241、9.387、13.298，P<0.05)。

表1 生存组、死亡组miRNA-130a、MELD评分、PT、PTA、APTT、INR比较

注：与生存组比较，bP<0.05

四、miRNA-130a与MELD评分、PT、PTA、APTT、INR相关性分析

miRNA-130a与MELD评分、PT、PTA、INR负相关明显，与APTT正相关明显(R=-0.654、-0.597、-0.593、-0.654、0.699，P<0.01)。

五、 mi RNA-130a、MELD评分对ACHBLF患者预后评估的诊断价值

受试者工作特征曲线提示，miRNA-130a ROC曲线下面积(AUC)为0.839(95%CI0.765～0.985)，MELD评分ROC曲线下面积(AUC)为0.777(95%CI0.587～0.903)，两者AUC相近(P>0.05), miRNA-130a、MELD评分对ACHBLF患者预后评估的灵敏度、特异度相近(0.802对0.857, 0.746对0.789),(χ2=2.134、1.987，P>0.05)。

讨 论

ACLF是在慢性肝病的基础上，短期内出现肝功能失代偿为主要表现的一组临床症状症候群[5]。我国90%的ACLF由HBV引发，称为ACHBLF。目前ACHBLF发病机制尚不明确，普遍认为与免疫损伤，缺血缺氧和内毒素血症相关。ACHBLF死亡率高达60%～80%，病情凶险，进展迅速，普遍预后差，严重威胁患者的健康。

研究发现外源性感染能引起miR-130a高表达，高度表达miR-130a蛋白的淋巴细胞株增殖能力明显高于野生株[6]。本研究中，ACHBLF组miRNA-130a mRNA表达水平明显高于对照，说明ACHBLF患者肝细胞受损，miR-130a mRNA大量释放入血，而生存组miRNA-130a mRNA表达水平明显高于死亡组，提示miRNA-130a具有促进ACHBLF患者良好预后的作用。 IL-8、血管内皮生长因子 (VEGF)可能由miR-130a调控，高表达miR-130a蛋白的淋巴细胞可分泌更多的IL-8、VEGF，而VEGF、IL-8在炎症的形成过程中发挥重要作用[7-9]。综上所述，ACHBLF患者血清miRNA-130a 表达水平上升，高水平表达的miRNA-130a能促进ACHBLF患者良好预后，其机制与miRNA-130a诱导免疫细胞因子产生有关。

本研究同时也发现，miRNA-130a与MELD评分、PT、PTA、INR负相关明显，与APTT正相关明显；而miRNA-130a、MELD评分ROC曲线下面积相近, miRNA-130a、MELD评分对ACHBLF患者预后评估的灵敏度、特异度相近；说明miRNA-130a具有较高的灵敏度、特异度，可作为判定ACHBLF患者预后的生物学标志物，值得在临床上推广应用。