禽腺病毒-I群PCR-RFLP分型方法的建立

江之瑶 ， 王守春 ， 栾庆东 , 尹燕博 ， 王建琳

(青岛农业大学动物医学院 ， 山东 青岛 266109)

禽腺病毒按照特异性抗原的不同可分为3个群，其中禽腺病毒-I群(Fowl adenovirus, FAdVs)共分为12个血清型(1～7、8a、8b、9～11)，FAdVs能引起禽心包积液综合征、包涵体肝炎、肌胃糜烂和再生障碍性贫血等[1]。FAdVs不仅可以水平传播，还可以垂直传播，对家禽养殖业造成了巨大威胁[2]。目前，检测FAdVs的经典方法主要有病毒的分离鉴定、病毒中和试验等。在实际生产中，以分子生物为基础的PCR检测方法是进行病原测定的主要方法[3]，但单纯的PCR检测方法无法区分FAdVs的血清型，需要后续进行基因测序分析等。

自2015年以来，FAdVs感染在我国广泛流行，尤其血清4型FAdVs给我国养禽业造成了巨大的经济损失。我国FAdVs感染有多种血清型，为快速准确的区分不同血清型 FAdVs感染，为后续的有效防控提供依据，本试验拟建立FAdVs的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)分型方法，用于临床FAdVs的快速分型。

1 材料与方法

1.1 毒株、载体与细胞 FAdVs的12个血清型 (购自中国兽医药品监察所)；感受态细胞 DH5α和pMD18-T 载体(TaKaRa公司)。

1.2 主要试剂与仪器 DMEM/F-12细胞培养液、胎牛血清、LB培养基、DNA Maker DL-2 000(TaKaRa公司)； DEPC水(北京索莱宝科技有限公司)；1×PCR Mix；DNAiso Plus(TaKaRa公司)；氯仿、异丙醇、乙醇(天津化学试剂三厂)。PCR基因扩增仪(TC-96/G/H(b)型，杭州博日公司)，电泳仪(JY600E型，君意东方公司)， 核酸电泳槽(JY-SPFT型，君意东方公司)，凝胶成像仪(JY04S-3C型，君意东方公司)，恒温水槽(HH.S11-2型，上海博讯公司)，超纯水仪(best-R型，上海芷昂公司)，离心机(Pico17型，ThermoFisher公司)，恒温培养箱(XT5116-IN70型，雪中炭公司)。

1.3 限制性内切酶Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI、Psy I、BgⅡ(Thermo Fisher公司)。

1.4 引物设计与合成 根据GenBank中 FAdV-I的Hexon基因，应用Premier5.0软件设计通用引物(表1)，并寻找酶切位点，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

表1 Hexon基因扩增用引物

1.5 病毒核酸提取与PCR扩增 取细胞毒上清200 μL，加入700 μL DNAisoPlus、140 μL 氯仿。轻柔混匀，室温静置10 min。12 000 r/min离心10 min,取上清500 μL，加入500 μL冷异丙醇。低温静置10 min。12 000 r/min离心 10 min 弃上清。加入1 000 μL冷75%乙醇，7 500 r/min离心5 min后弃上清，重复操作2次。室温敞口干燥，确保乙醇挥发干净后加入DEPC 水35 μL，轻弹，使核酸彻底溶解，置于-80 ℃冰箱备用。

PCR反应体系为PCR Mix 45 μL,模板1 μL，上下游引物各2 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR结束后，电泳鉴定连接载体并测序。

1.6 目的基因的酶切及图谱分析 取PCR产物7 μL，加入DEPC 水10 μL，限制性内切酶1 μL，10×Fast Digest Buffer 2 μL。于恒温箱中37 ℃酶切30 min。电泳确认酶切结果。

2 结果与分析

2.1 毒株扩增和测序结果 利用本试验所设计的引物，经PCR扩增，FAdVs的12个血清型均得到了与预期条带大小一致的片段，约894 bp(图1)，连接载体测序结果为FAdVs(1～7、8a、8b、9～11)型。经序列分析，各毒株的片段与GenBank中所登录的FAdVs的同源性和覆盖率均为98%～100%。

图1 12个血清型FAdV-I Hexon基因PCR扩增结果
M:DNA Marker DL-2 000 ; 1～12:FAV1-7、8a、8b、9-11PCR产物

2.2 PCR产物的酶切电泳结果与分析 FAdVs(1～7、8a、8b、9～11)Hexon基因894片段的限制性内切酶酶切位点分析发现，Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI、PsyI、BgⅡ组合酶切后有良好的特异性，能有效区分全部12个血清型。

12种血清型FAdVs的PCR片段的Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI 、PsyI、BgⅡ组合酶切结果见图2、图3和图4。片段经Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI 、PsyI、BgⅡ组合酶切后得到了12种RFLP图谱，可以区分出12种血清型的FAdVs，酶切结果与软件分析结果一致。

图2 FAV-I Hexon基因扩增片段Pf 123Ⅱ和BgⅡ酶切结果
M: DNA Marker DL-2 000 ; 左侧1～7、8a、8b、9～11:12个血清型FAdVsHexon基因扩增片段的Pf123Ⅱ酶切结果 ; 右侧1～7、8a、8b、9～11:12个血清型FAdVs 的BgⅡ酶切结果

图3 FAdVs Hexon基因扩增片段Eco130 I和Mlu I酶切结果
M:DNA Marker DL-2 000 ; 左侧1～7、8a、8b、9～11:12个血清型FAdVsHexon基因扩增片段的Eco130 I酶切结果 ; 右侧1～7、8a、8b、9～11:12个血清型FAdVsHexon基因扩增片段的MluI酶切结果

图4 FAdVs Hexon基因扩增片段Psy I酶切结果
M:DNA Marker DL-2 000; 1～7、8a、8b、9～11:12个血清型FAdVsHexon基因扩增片段的PsyI酶切结果

2.3 临床样本测定 本实验室2株(RZ株、YTPL株)临床分离株经Hexon全基因扩增，PCR产物测序确认为FAdVs-4和FAdVs-11。这2个毒株应用上述建立的PCR-RFLP方法进行测定，得到酶切图谱(图5、图6)，经分析比对其图谱条带与FAdVs中的FAdVs-4、FAdVs-11型的酶切图谱相符合。

图5 RZ株酶切图谱
M:DNA Marker DL-2 000 ; 1:Pf123Ⅱ; 2:PsyI ;3:Eco130 I ; 4:MluI ; 5:BgⅡ

3 讨论

FAdVs共有12个血清型(FAdVs 1～7、8a、8b、9～11)，多数血清型的腺病毒都能引起禽类严重的疾病，不同血清型的腺病毒致病性和所引起的症状不完全相同[4]。FAdVs还容易与新城疫病毒、鸡传染性贫血病毒、传染性支气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒和大肠杆菌等病原混合感染，对家禽养殖业造成了巨大损失[5]。由于不同血清型的FAdVs之间有不同程度的交叉中和作用[6]，所以以血清学方法为基础的分型方法尚未建立[7]。本试验建立的方法与序列测定相比较更加简便、快捷。本试验中所设计的引物能良好的扩增出FAdVs全部12种血清型，以该引物为基础的PCR-RFLP有良好的通用性。

图6 YTPL株酶切图谱
M:DNA Marker DL-2 000; 1:Pf123Ⅱ; 2:PsyI;3:Eco130 I; 4:MluI; 5:BgⅡ

Zsak等[8]利用BamH I和HindIII对FAdVs进行PCR-RFLP分析，将FAdVs分为5种不同的A～E亚群，研究表明有一定致病性的禽腺病毒毒株之间的基因型具相关性。其中A亚群包含FAdVs-1；B亚群含FAdVs-5；C亚群含FAdVs-4；D亚群包含FAdVs-2、FAdVs-3、FAdVs-9和FAdVs-11；E亚群包含FAdVs-6、FAdVs-7、FAdVs-8a和FAdVs-8b，但其方法不能将全部血清型的FAdVs区分。李海英等[9]根据Hexon全基因的酶切位点，建立了利用限制性内切酶HaeⅡ分型方法，能区分FAdVs；但该方法需要扩增Hexon基因的全长，约2 500 bp，且该方法所得到的酶切图谱可以区分出FAdVs-3、4、6、8 b、9、10 这6种血清型，而FAdVs-1、2、5、7、8a和11这6种血清型由于酶切条带太过接近，无法区分，故该方法无法完全区分出FAdVs的 12个血清型。而本试验中同样扩增FAdVsHexon基因，但其片段长度较短，易于扩增；且选用限制性内切酶Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI 、PsyI、BgⅡ对扩增片段进行酶切分析，酶切图谱区分度良好，能很好地区分出FAdVs的12个血清型。G.Meulemans等[10]使用与本试验相同的引物，对FAdVs的Hexon基因进行扩增，并对所得到的PCR产物利用BsiW I、Sty1、MluI、AspI、ScaI和BgⅡ这6种限制性内切酶进行酶切，所得到的酶切图谱可以将12个血清型的FAdVs区分。与该报道相比，本试验只需要Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI 、PsyI和BgⅡ这5种限制性内切酶即可完成酶切，故更具有简便性。

为简化操作，本试验采用统一温度、统一反应时间进行限制性内切酶酶切，且可得到良好的酶切效果，故该方法较为简便。建立的PCR-RFLP方法对临床分离株进行酶切分析，其鉴定的血清型结果与Hexon基因的测序结果相一致，表明该方法具有准确性。

故本试验基于Hexon基因建立的FAdVs PCR-RFLP分型方法，具有准确性、简便性和良好的区分性，可用于临床FAdVs的分型诊断。