白藜芦醇对碘海醇所致糖尿病大鼠肾损伤的作用及其机制

庞天舒，王岩 ，左中夫，任克 ，刘学政

（1. 锦州医科大学附属辽河油田总医院疾病预防控制科，辽宁 盘锦 124010； 2. 锦州医科大学基础医学院解剖学教研室，辽宁 锦州 121000；3. 中国医科大学附属第一医院放射科，沈阳 110001）

对比剂肾病是因对比剂而导致的急性肾功能衰竭，有研究［1-2］发现低渗透型对比剂碘海醇，因高含碘量在体内以原形由肾小球滤过而不被肾小管吸收，脱水时该药在肾内浓度增高，可致肾损害而发生急性肾衰竭。糖尿病是对比剂肾病的危险因素之一，糖尿病患者发生对比剂肾病的概率高达50%［3］。沉默接合型信息调节因子2同源蛋白-1（silent mating type information regulation 2 homolog-1，SIRT1） 是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的组蛋白去乙酰酶，在细胞的分化、增殖、凋亡、衰老、抵抗炎症、延长细胞存活时间等方面都发挥着重要的作用［4-9］。近年来发现，SIRT1唯一激动剂——白藜芦醇 （resveratrol，Res） 可以抑制细胞凋亡，改善糖尿病肾病大鼠肾功能损伤［10］，但其具体机制有待证实。低氧诱导因子-1 （hypoxia inducible factor-1，HIF-1）在严重缺氧条件下或缺氧的早期阶段，HIF-1与P53相互作用，诱导凋亡，有研究［11］发现，SIRT1可以通过调控HIF-1的表达影响凋亡。本研究探讨Res对碘海醇所致糖尿病大鼠肾损伤的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级糖尿病大鼠45只，雄性，体质量250～300 g，购自北京维通利华公司［生产许可证号：SCXK（京） 2012003］。采用随机数字法分为3组：假手术组（Sham组，n = 15）、碘海醇组 （NL组，n = 15） 和Res组（n = 15）。

1.2 模型制备

采用文献［12］对比剂肾损伤模型建立方法，Res组大鼠给予Res （100 mg/kg） 灌胃，NL组及Sham组给予等量生理盐水，连续给药5 d，第6天大鼠禁食水，第7天大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定，剥离股静脉，穿刺股静脉，NL组及Rse组先后注射吲哚美辛 （10 mg/kg）、左旋硝基精氨酸甲酯 （10 mg/kg）、碘海醇 （3 g/kg），每次给药间隔15 min，Sham组同时间注射等量生理盐水，待大鼠平稳后，逐层缝合。

1.3 样品采集

模型建立48 h后过量麻醉处死大鼠，经下腔静脉取血 （5 mL），部分送检验科检测血清肌酐 （serum creatinine，Scr） 和血尿素氮 （blood urea nitrogen，BUN），另一部分低温冰箱保存用于ELISA检测，然后于腹主动脉注入大量冷冻生理盐水，直至流出清亮液体，剥离肾脏，于PBS缓冲液中剔除肾脏周围脂肪及其他组织，一部分于甲醛中固定用于HE染色及TUNEL检测，另一部分锡纸包裹于-80 ℃冰箱保存，用于Western blotting及qRT-PCR检测。

1.4 HE染色

取多聚甲醛中固定的肾脏组织，流水冲洗1 h，滤纸浸干，分别置于70%、80%、90%、100%乙醇中，二甲苯中20 min，浸蜡中3 h，包埋机包埋，切片机切片，厚度4～6 μ m，将切片放入37 ℃烤箱中过夜，再分别2次放入二甲苯中进行脱蜡处理，完成脱蜡的切片放入浓度递减的梯度乙醇中脱水，之后进行苏木素染色5 min，酸化水反蓝，伊红染1 min，分别浸80%、90%、95%、100%乙醇1 min，二甲苯5 min，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.5 ELISA 检测

为观察Res对碘海醇导致的糖尿病肾病大鼠氧化应激及肾功能影响，采用ELISA试剂盒 （武汉USCN公司） 检测大鼠总超氧化物歧化酶 （total superoxide dismutase，T-SOD）、丙二醛 （malondialdehyde，MDA） 和谷胱甘肽过氧化物酶 （glutathione，GPX） 的含量，具体操作步骤参照说明书进行，空白孔加样品稀释液 （100 μ L），余孔分别加标准品或待测样品 （100 μ L），37 ℃孵育2 h；弃去液体，甩干，每个孔中加入Detection Ab工作液 （100 μ L），37 ℃温育1 h；弃去孔内液体，洗板 3次；每孔加HRP Conjugate工作液（ 100 μ L），37 ℃温育1 h；弃去孔内液体，甩干；每孔加底物溶液（ 100 μ L），37 ℃避光孵育15 min左右；每孔加终止液（ 50 μ L）终止反应，酶标仪在450 nm波长测量各孔光密度（ optical density，OD）。

1.6 TUNEL检测

切片，常规脱蜡，水化，3%H2O2甲醇溶液，室温下30 min，封闭过氧化物酶，洗涤；滴加蛋白酶K工作液，37 ℃孵育，恢复至室温，洗涤； 0.1%TritonX-100，1%枸盐酸钠溶液，恢复室温，洗涤；滴加反应混合物，37 ℃孵育90 min，洗涤，正常山羊血清封闭，室温20 min，弃去血清，滴转化POD溶液，37 ℃孵育30 min，恢复室温，洗涤。光镜下阳性细胞核染色为棕黄色，水洗终止反应。

1.7 Western blotting检测

将肾脏组织加入RIPA细胞裂解缓冲液中电动匀浆器均浆、离心后聚氰基丙烯酸正丁酯 （bicinchoninic acid，BCA） 蛋白定量试剂盒 （南京凯基生物公司） 对蛋白进行定量后进行电泳，转膜，过夜。加入SIRT1 （ab110304）、HIF-1 α （ab187524） 抗体，4 ℃孵育过夜，再将其与过氧化物酶标记的羊抗兔IgG室温下反应，室温孵育2 h后将膜与增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL） 反应后曝光显色，结果使用Image Tools （Irbis Technologies） 进行吸光度分析，实验结果以相应蛋白条带的OD比值来表示。

1.8 qRT-PCR检测

将收集的组织充分研磨，加入Trizol （美国Invitrogen公司，15596026） 溶液中，按照Trizol试剂操作说明书分离提取组织和细胞中的总RNA，反转录合成第一链cDNA后，按照qRT-PCR法检测SIRT1、HIF-1 α反应，参照试剂盒操作说明书配制，引物序列：SIRT1，上游引物，5’-CAGCATTGCCCAGAAGAA -3’；下 游 引 物 ，5’-CGTGGAGGACAGTGTAGGTG -3’。HIF-1α，上游引物，5’-TGCTGCTACTGCTCTG -3’；下游引物，5’-TGGAGTGAGGACGAAC-3’。β-actin，上游引物，5’-CATCTACGAGGGCTACGC -3’，下游引物，5’-TCTCCTTGATGTCCCGCA-3’。由上海生工生物公司进行合成。反应条件为预变性95 ℃ 30 s；PCR反应95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循环40次； 融解曲线分析95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s。反应结束后确认扩增曲线和融解曲线。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠肾脏病理学结果

模型建立48 h后，HE染色观察肾脏病理学变化。结果显示，Sham组大鼠肾小管上皮细胞排列规则，肾小管结构正常；NL组大鼠肾小管空泡变性，细胞脱落至小管腔，肾小管结构破坏，提示碘海醇可以导致糖尿病大鼠肾脏形态学改变，建模成功。Res组仅见少量肾小管细胞空泡变性，部分细胞脱落至小管腔，肾小管结构基本正常，提示Res可以改善碘海醇导致的糖尿病大鼠肾功能损伤，见图1。

2.2 各组大鼠血清总Scr和BUN比较

图1 各组大鼠肾脏病理学HE染色结果×200Fig.1 HE staining of renal tissue in each group ×200

进一步检测大鼠血清总Scr和BUN情况，结果显示，建模48 h后，与Sham组比较，NL组大鼠血清总Scr、BUN含量明显升高 （P ＜ 0.05）；与NL组比较，Res组大鼠血清总Scr、BUN含量明显降低 （均P ＜ 0.05），与病理学结果一致，提示碘海醇可以诱导糖尿病大鼠肾功能损伤，Res可以改善碘海醇诱导的糖尿病肾损伤。见表1。

2.3 各组大鼠 T-SOD、MDA和GPX含量比较

表1 各组大鼠血清BUN和Scr含量比较Tab.1 Comparison of plasma BUN and Scr levels in each group

ELISA法检测结果显示，建模48 h后与Sham组比较，NL组大鼠血清中MDA含量显著升高，而T-SOD和GPX显著降低 （均P ＜ 0.05），提示碘海醇可以通过促进氧化应激诱导糖尿病大鼠肾损伤。与NL组比较，Res组大鼠血清中T-SOD和GPX含量显著升高 （均P ＜ 0.05），MDA显著降低 （P ＜ 0.05），提示Res可以通过抑制氧化应激改善碘海醇诱导的糖尿病大鼠肾损伤，见表2。

2.4 TUNEL检测结果比较

Res对碘海醇诱导糖尿病大鼠肾损伤的影响通过TUNEL检测显示，与Sham组比较，NL组大鼠肾小管上皮细胞凋亡明显。与NL组比较，Res组仅见少量肾小管上皮细胞凋亡。提示Res可以抑制肾小管上皮细胞凋亡，减轻肾功能损伤。 见图2。

表2 各组大鼠血清中T-SOD、GPX和MDA含量比较Tab.2 Comparison of serum T-SOD，GPX，and MDA levels in each group

2.5 各组大鼠SIRT1、HIF-1 α蛋白表达比较

图2 各组大鼠TUNEL结果 ×200Fig.2 TUNEL results of each group of rats ×200

为观察Res对碘海醇诱导对比剂肾损伤大鼠SIRT1、HIF-1 α蛋白表达的影响，采用Western blotting检测SIRT1、HIF-1 α蛋白表达，结果显示，与Sham组比较，NL组大鼠HIF-1 α表达明显是升高，而SIRT1表达明显降低 （P ＜ 0.05）；与NL组比较，Res组大鼠SIRT1表达明显升高，而HIF-1 α明显降低 （P ＜0.05）。见图3、表3。

2.6 各组大鼠SIRT1、HIF-1α mRNA 表达比较 （表3）

图3 Western blotting检测肾组织中SIRT1和HIF-1 α蛋白表达水平Fig.3 SIRT1 and HIF-1 α protein expression in the renal tissue of rats detected by Western blotting

表3 各组大鼠肾组织中SIRT1和HIF-1 α蛋白、mRNA表达水平Tab.3 SIRT1 and HIF-1 α protein and mRNA expression in the renal tissue of rats

qRT-PCR检测SIRT1和HIF-1α mRNA水平，结果显示，与Sham组比较，NL组大鼠HIF-1α mRNA表达明显是升高，而SIRT1 mRNA表达明显降低 （P ＜ 0.05）；与NL组比较，Res组大鼠SIRT1 mRNA表达明显升高，而HIF-1α mRNA明显降低 （P ＜ 0.05），与Western blotting结果一致，提示Res可以通过调控SIRT1、HIF-1 α蛋白表达，抑制肾小管上皮细胞凋亡，改善碘海醇所致的糖尿病大鼠肾损伤。

3 讨论

本研究利用碘海醇建立糖尿病大鼠肾损伤模型，采用HE染色、 ELISA、 Western blotting、 qRT-PCR等技术，观察Res对大鼠肾小管损伤、凋亡、氧化应激及SIRT1和HIF-1 α蛋白表达影响，结果发现Res可以减轻碘海醇导致的大鼠肾小管上皮细胞损伤，抗氧化应激，抑制细胞凋亡，此外还发现Res可以上调碘海醇诱导糖尿病肾损伤大鼠肾脏组织中SIRT1蛋白表达，而使HIF-1 α蛋白表达显著降低，提示Res可以减轻碘海醇诱导的糖尿病大鼠肾功能损伤，其机制可能与调控SIRT1及HIF-1 α蛋白表达，抑制细胞凋亡有关。

研究［13-14］表明，对比剂肾病已成为含碘对比剂注射之后的严重并发症之一，仅次于肾灌注不足和肾毒性药物，成为引起医院获得性肾衰竭的常见原因，约占医源性急性肾功能衰竭的10%。糖尿病是对比剂肾病的危险因素之一，其发生机制尚不清楚，可能与肾脏血流动力学改变、肾脏低氧、低灌注、氧化应激、炎症、细胞损伤、对比剂造成的肾小管直接毒性作用等多种因素相关［15］。目前普遍认为对比剂对肾小管供氧平衡的破坏是损伤发生和发展的主要机制之一。正常情况下，人体存在氧自由基的产生和清除，SOD主要反映自由基造成的细胞伤害［16］，GPX能有效清除生物体内的自由基［17］，MDA反映过氧化物损伤程度［18］，本研究利用对比剂碘海醇诱导糖尿病肾损伤大鼠模型，发现建模48 h后，大鼠肾小管上皮细胞损伤，凋亡，细胞脱落至肾小管腔，肾小管结构破坏，血清总Scr、BUN、MDA均升高，T-SOD、GPX降低，提示碘海醇可以导致糖尿病大鼠肾功能损伤及肾小管上皮细胞凋亡，其机制可能与氧化应激有关。

Res具有调节血脂水平、防止低密度脂蛋白氧化、抗血小板凝集、抗肿瘤、抗氧化及抗自由基的作用［19］，近年来Res在肾脏疾病中广泛应用，JEFREMOV等［20］研究发现Res可以有效清除金属诱导基团和超氧化物，对活性氧 （reactive oxygen species，ROS）引起的DNA损伤具有保护作用。PALSAMY等［21］研究发现Res可以通过抗氧化应激、抑制细胞凋亡对糖尿病肾病大鼠肾功能产生保护作用，但目前对于Res对对比剂肾病预防和治疗机制尚未清楚，本研究利用Res干预碘海醇诱导糖尿病肾损伤大鼠，结果发现，Res可以减轻碘海醇引起的糖尿病大鼠肾小管损伤及凋亡，抑制其氧化应激反应，对碘海醇诱导的糖尿病大鼠肾损伤具有保护作用，其机制可能与抑制氧化应激有关。

SIRT1是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的组蛋白去乙酰酶，在细胞的分化、增殖、凋亡等方面发挥着重要的作用［22］，HIF-1是具有转录活性的核蛋白，是与缺氧适应、炎症发展及肿瘤生长等作用相关的靶基因，与SIRT1关系密切［23］，研究发现SIRT1可以通过调控HIF-1 α影响细胞凋亡，而关于缺氧组织内HIF-1诱导或抑制细胞凋亡的机制，有研究［24］认为与Bcl-2和P53等基因有关，P53是凋亡相关基因，而Bcl-2 具有抑制凋亡作用。本研究发现，建模48 h后，SIRT1表达明显降低，而HIF-1 α表达明显升高，提示碘海醇诱导糖尿病大鼠肾损伤可能与调控SIRT1及HIF-1 α蛋白表达、促进肾小管上皮细胞凋亡有关，而Res可能通过调控SIRT1及HIF-1 α蛋白表达来抑制碘海醇诱导的糖尿病大鼠肾小管上皮细胞凋亡。其机制可能与调控SIRT-1及HIF-1 α蛋白表达有关。