二氯乙酸钠对氧糖剥夺损伤的BV2细胞的保护作用及其机制研究

赵 辉，章越凡，李铁军,3

(1.安徽中医药大学药学院 ，安徽 合肥 230012；2.海军军医大学药学院药理学教研室，上海200433；3.上海市浦东新区浦南医院药剂科，上海200125)

缺血性卒中是一种常见的神经系统性疾病，是导致死亡的主要原因[1]。胶质细胞是脑内的天然免疫效应细胞，参与一系列神经退行性病变[2]。活化的小胶质细胞释放促炎因子以及细胞毒性因子(如NO和ROS)，导致神经元损伤[3]。研究表明，小胶质细胞激活诱发的炎症反应参与了脑卒中的损伤过程[4]。二氯乙酸钠(DCA)是一种可口服吸收的小分子化合物，临床上可用于治疗线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(MELAS)综合征、先天性乳酸性酸中毒和其他疾病的儿童[5]。最近的研究发现，DCA通过抑制 PDK2和减少冠状动脉肌内膜增生而起到潜在的血管保护作用[6]，并促进脑缺血后的脑再生[7]。笔者使用 BV2细胞的OGD损伤模型，探讨DCA治疗是否具有保护作用及其可能的作用机制。

1 材料

1.1 细胞株

BV2细胞购自中科院上海细胞库，培养在含10% FBS的DMEM完全培养基中(37℃，5% CO2)，每48 h更换培养基并传代。

1.2 药物与试剂

二氯乙酸钠(DCA，TCI公司，货号：D1719)； DMEM完全培养基、DMEM无糖培养基 (Gibco 公司)；凋亡检测试剂盒、NO试剂盒、ROS试剂盒、蛋白质提取试剂盒(上海碧云天生物技术公司) ；抗体:β-actin， SAPK/JNK， P-SAPK/JNK， I-κB， P-I-κB， stat3， P-stat3， NF-κB， P-NF-κB (CST公司)。

1.3 仪器

细胞培养箱(Thermo 公司)；高速水平离心机 (Eppendorf公司)；缺氧装置(Billups-Rothenberg 公司)；酶标仪(Thermo 公司)；流式细胞仪 (BD Biosciences公司); Western blot 图像扫描仪(Odyssey公司)。

2 方法

2.1 OGD 模型的建立

参考文献[8]建立体外模拟脑缺血模型，即OGD模型，并根据本实验目的稍作修改。细胞接种在细胞培养板中。细胞贴壁后，对照组更换为不含血清的DMEM，OGD组用无糖 DMEM培养基，DCA给药组更换为加有 DCA的无糖 DMEM培养基，于培养箱中适应1 h，然后置于缺氧装置中，通入混合气(95%N2、5% CO2)密闭后，置于培养箱中，1～4 h后取出细胞，做后续处理。

2.2 CCK8法测定细胞活力

将BV2细胞以1.2×105个/ml的密度接种于96孔板中，按照“2.1”项下操作方法，在 OGD之前将给药组更换为加入不同浓度的二氯乙酸钠( 1、10、100、400、800 μmol/L)适应性培养1 h，OGD组和给药组置于缺氧装置中OGD 4 h后，采用 CCK-8法检测细胞活力， 用酶标仪测定450 nm处上述不同浓度组的吸光度值(A)。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡

以1.0×106个/ml的密度将 BV2细胞接种于6孔板中，分为对照组、OGD组和给药组，细胞贴壁后，OGD组更换为无糖 DMEM培养基，给药组更换为加有DCA的无糖 DMEM培养基，适应性培养1 h后，OGD组和给药组置于缺氧装置中OGD 4 h，之后分别收集各组细胞，使用凋亡试剂盒对细胞进行处理，流式细胞术检测细胞凋亡。

2.4 流式细胞术检测细胞内ROS和NO的表达

以1.0×106个/ml的密度将 BV2细胞接种于6孔板中，细胞贴壁后，OGD组更换为无糖 DMEM培养基，给药组更换为加有DCA的无糖 DMEM培养基，适应性培养1 h后，OGD组和给药组置于缺氧装置中OGD 4 h，之后分别收集各组细胞，按照相应的ROS和NO检测试剂盒说明书对细胞进行前处理，流式细胞术检测ROS和NO含量。

2.5 Western blot 检测蛋白表达

以1.0×106个/ ml的密度将 BV2细胞接种于6孔板中，细胞贴壁后，OGD组更换为无糖 DMEM培养基，给药组更换为加有DCA的无糖 DMEM培养基，然后 OGD 4 h， 结束后分别收集各组细胞，置于 预冷的RIPA裂解液中裂解30 min，离心，取上清液。BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。10% SDS-PAGE分离蛋白，转移至硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜用含有5%脱脂奶粉的 Tris缓冲液封闭2 h， 4 ℃环境下一抗孵育过夜，弃去一抗，漂洗3次(5 min/次)，室温下与二抗孵育1 h后洗涤膜。使用Western blot 图像扫描仪进行扫描统计。

2.6 统计分析

使用SPSS 17.0软件进行统计分析。数据以(均数±标准差)表示。t检验用于组间比较，P<0.05时表示有统计学意义。

3 结果

3.1 DCA对OGD诱导的 BV2 细胞损伤的保护作用

OGD 1～4 h后，细胞生存率显著降低，与对照组比较有显著性差异(P<0.01)，以 OGD 4 h为最佳时间(图1A)。DCA浓度为400 μmol/L可显著提高 OGD 4 h后的细胞活力(P<0.01)，因此选择 OGD 4 h，给药浓度400 μmol/ L作为后续试验条件(图1B)。

图1 DCA对OGD诱导BV2细胞损伤的影响 A.不同的OGD时间；B.不同的DCA浓度(μmol/L)*P<0.05,**P<0.01,与对照组比较；##P<0.01,与OGD组比较

3.2 DCA降低OGD诱导的 BV2 细胞凋亡

为了考察DCA对 OGD 损伤的BV2细胞凋亡的影响，本研究采用流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示(图2)，与对照组相比， OGD诱导细胞的凋亡率增加，由对照组(2.62±0.22)%上升到(8.55±0.37)%(P<0.01)，而DCA可显著减少细胞凋亡，凋亡率降至(3.95±0.16)% (P<0.01)。

3.3 DCA降低OGD诱导的BV2细胞中ROS和NO的含量

与对照组相比， OGD提高了BV2细胞中ROS和NO的含量 (P<0.01); 而DCA可显著降低BV2细胞内ROS(P<0.01)和NO(P<0.05)的含量(图3)。

3.4 DCA 对 NF-κB/STAT3信号通路的调节作用

NF-KB信号通路广泛参与凋亡、炎症反应，因此本研究检测了 DCA对该信号通路的影响。结果如图4A和图4B所示， OGD损伤后 P-NF-κB、 P-JNK及 P-I-κB的表达水平均显著升高(P<0.01)； DCA可显著下调 OGD诱导的P-NF-κB，P-JNK(P<0.05)及 P-I-κB蛋白的升高(P<0.01)。而 STAT3在脑卒中血管生成方面起到重要作用， OGD后 P-STAT3表达显著上调(P<0.01)，而 DCA治疗组 P-STAT3表达显著降低(P<0.05)。

图2 DCA对OGD诱导的 BV2 细胞凋亡率的影响 A.流式细胞术检测细胞凋亡情况；B.细胞凋亡比例 **P<0.01,与对照组比较；##P<0.01,与OGD组比较(n=3)

图3 DCA对OGD诱导的 BV2 细胞内ROS和NO含量的影响 A.流式细胞术检测细胞内ROS含量；B.ROS含量统计图；C.流式细胞术检测细胞内NO含量；D.NO含量统计图**P<0.01,与对照组比较；#P<0.05,##P<0.01,与OGD组比较(n=3)

4 讨论

卒中是由血管阻塞或出血引起的脑血液循环障碍并诱发脑神经系统的损伤，致死率较高，其病理机制复杂， 目前仍缺乏有效的治疗方法，而炎症反应已被证实为卒中诱发损伤中一个关键影响因素。小胶质细胞的激活是诱发卒中炎症反应的主要原因之一[9]，激活的小胶质细胞在形态及功能上会发生明显改变，并在炎症部位产生大量的神经毒素和促炎症介质， 从而导致神经元损伤，并且会释放促炎因子和细胞毒性因子，如IL-1、IL-6、TNF-α、NO和ROS[4]。因此，降低小胶质细胞的激活以及抑制其细胞毒性因子的释放对神经元的保护具有重要作用。

图4 DCA 对OGD诱导下BV2细胞 NF-κB/STAT3通路的影响 A.Western blotting检测JNK、NF-κB、I-κB、STAT3及其磷酸化蛋白的表达水平；B.p-JNK/JNK比值；p-NF-κB/NF-κB比值；p-I-κB/I-κB比值；p-STAT3/STAT3比值**P<0.01,与对照组比较；#P<0.05,##P<0.01,与OGD组比较(n=3)

最新研究表明， DCA在血管保护和促进血管内皮修复中起着重要作用[6]，可以改善动脉粥样硬化患者的血管钙化[10]。然而，DCA对小胶质细胞激活引起的炎症反应的作用尚无研究报道。 本实验研究了DCA对OGD诱导的BV2小胶质细胞凋亡和炎症反应的抑制作用，并初步探讨其可能的机制。首先建立 OGD损伤BV2细胞模型，同时加入不同浓度的DCA进行处理。结果发现，DCA可剂量依赖性地抑制 OGD介导的BV2细胞损伤，并且当 DCA浓度为400 μmol/L时抑制作用最强。于是，笔者选择400 μmol/L给药剂量进行机制探讨。

本研究结果表明，经过OGD损伤，BV2细胞凋亡明显增加并且细胞内 ROS和 NO水平显著升高， 而 DCA可显著抑制细胞凋亡并下调细胞内ROS、 NO的水平， 提示DCA可能通过抑制BV2细胞激活后ROS和NO的水平发挥神经保护活性。为进一步探讨 DCA是否通过抗炎作用发挥对小胶质细胞的保护作用，笔者对 JNK、 I-κB和 NF-κB的蛋白表达， I-κB磷酸化水平以及 NF-κB磷酸化水平进行检测。NF-κB作为促炎因子基因表达的最主要调节者之一[11]，与脑缺血再灌注损伤中神经炎症的发生及小胶质细胞激活密切相关[12]。 I-κB是 NF-κB信号通路的重要组成，正常情况下，I-κB和NF-κB形成复合体存在于胞质中。当受到胞外信息刺激时， I-κB发生磷酸化并被泛素-蛋白酶体系统降解，导致 NF-κB p65核结合位点暴露并使之发生核转位， NF-κB p65入核后与相关免疫基因结合进而促进这些基因转录。本研究结果显示，OGD诱导的 BV2 细胞激活伴随JNK、I-κB 、NF-κB磷酸化水平的增加； 而DCA处理可显著抑制上述改变。结合 DCA对 OGD所致BV2细胞激活后 ROS、 NO表达的降低，表明DCA可能通过抑制 JNK/I-κB/ NF-κB信号通路的激活，进而抑制 OGD诱导的BV2细胞炎症反应，最终发挥神经保护作用。

本研究结果表明，DCA能够显著抑制 OGD诱导的BV2细胞凋亡并且可以减少细胞内ROS和NO的水平，并通过调控NF-κB/STAT3信号通路产生抗炎及神经保护作用。DCA可能在脑缺血中对小胶质细胞引起的损伤具有保护作用。进一步的研究需要在脑缺血动物模型上更深入地解释DCA对脑缺血的影响及其作用机制，为DCA在临床用于缺血性脑卒中的治疗提供药理学理论基础。