复方扶正养肝颗粒的制备工艺研究

陈 坤，陈凌云，王华宁

(1.云南中医学院，昆明 650500；2.云南省中医医院，昆明 650021)

扶正养肝汤由蓝花参、黄芪、白术、柴胡、白芍和土茯苓等中药组成，具有扶正固本、清热利湿和解毒化浊之功效。该方为云南省中医医院脾胃病科治疗病毒性肝炎的协定处方，前期临床及实验研究表明，扶正养肝方对病毒性肝炎患者肝功能具有较好的改善作用，能明显降低刀豆蛋白A (Con A)诱导免疫性肝损伤模型小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)，下调细胞因子IFN-γ表达[1-2]。该方原为汤剂，为使患者服用、携带方便，本研究拟将其开发成医疗机构制剂。

1 仪器与试药

1.1仪器 1100Series高效液相色谱仪(包括四元梯度泵、自动进样器、二极管阵列检测器和柱温箱，美国安捷伦公司)；SK3300LH超声仪(上海科导超声仪器有限公司)；AB265-S分析天平[0.000 01 g，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；Kromat Universil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，S/N:0J7U73，科瑞迈公司)；OSB-2100旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社)；数显恒温水浴锅(北京永光明医疗仪器厂)；休止角测定仪(宁波海曙瑞柯仪器有限公司)。

1.2试药 毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号111920-201606，质量分数≥98%)；可溶性淀粉、糊精、麦芽糊精以及水溶液性淀粉(药用级,安徽山河药物辅料有限公司)；乙腈(色谱纯，德国Merck公司，批号1685730321)；甲酸(分析纯，天津市化学试剂三厂，批号110108)；水为娃哈哈纯净水；黄芪、白芍和土茯苓等药材均由云南省中医医院提供。

2 方法与结果

2.1扶正养肝颗粒提取工艺研究

2.1.1吸水率的考察 按中药组方比例称取1/2处方量饮片，每份72.5 g，共6份，每份加入水500 mL，分别浸泡15,30,45,60,75和90 min，滤净饮片表面的可流动溶剂，并称定浸泡后饮片的质量，比较浸泡后饮片的质量变化，以吸水率为评价指标，确定最佳浸泡时间，重复此过程3次，取平均值，结果表明，最佳浸泡时间为60 min，吸水率为125%。

2.1.2因素水平的确定 在预实验以及查阅文献的基础上[3-8]，选择加水倍数、提取时间和提取次数3个因素，以干膏得率和毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率综合评分为指标进行考察，对实验结果进行方差分析，考察各因素对实验的影响程度大小，最终确定各参数的水平，据此选择最佳提取工艺条件。因素水平表见表1。

表1 正交实验因素与水平

Tab.1 Orthogonal test factor and levels

水平因素A,加水倍数B,提取时间/hC,提取次数181.012101.523122.03

2.1.3评价指标 干浸膏得率：按照处方比例称取饮片145 g，置于圆底烧瓶中，加适量水浸泡60 min，按正交表所列条件进行回流提取，滤液浓缩至约250 mL上述溶液，置于250 mL量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精密吸取25 mL上述溶液，置于已干燥至恒质量的蒸发皿中，水浴蒸干，残渣置于105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，置于干燥器中冷却0.5 h，迅速称定其质量，计算干浸膏得率。结果见表2。

毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率：色谱条件[9-12]：以乙腈-2 mL·L-1甲酸(13∶87)为流动相；柱温为20 ℃，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为260 nm；理论板数以毛蕊异黄酮峰计算应不低于3 000。

2.1.4溶液的制备 对照品溶液:精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，加甲醇溶解并稀释成质量浓度为78 μg·mL-1的对照品溶液。

复方供试品溶液：称取1倍处方量，回流提取，滤液浓缩，定容至刻度，精密吸取定容液25 mL，水浴浓缩至干，残渣加甲醇定容至25 mL量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

药材供试品溶液：精密称取黄芪粉末1 g，置于圆底烧瓶中，加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流4 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取续滤液，即得[12]。

阴性对照溶液：按照处方比例制成缺黄芪的阴性样品，按照复方供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.1.5专属性考察 分别精密吸取对照品溶液、药材供试品溶液、复方供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1，结果表明专属性良好。

2.1.6线性与范围 精密吸取对照品溶液2，5，10，15，20和25 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积值为纵坐标(y)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷进样量(μL)为横坐标(x)进行线性回归，标准曲线方程为y=3 048.3x-0.130 6(r=0.999 7)，结果表明毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量在0.156～1.95 μg间峰面积与进样量呈良好的线性关系。

2.1.7精密度实验 精密吸取2.1.4项下制备的对照品溶液10 μL，按照2.1.3项下色谱条件重复进样6次，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的RSD值为0.23%，表明仪器精密度良好。

2.1.8重复性实验 精密移取定容液25 mL，共6份，按照2.1.4项下复方供试品溶液制备方法处理，进行含量测定，计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的RSD值为1.57%。结果表明，该方法重复性良好。

图1 HPLC图

A.对照品溶液；B.药材供试品溶液；C.复方供试品溶液；D.阴性对照溶液；1.毛蕊异黄酮葡萄糖苷。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference solution；B.herbs sample solution；C.compound sample solution；D.negative solution；1.calycosin-7-glucoside.

2.1.9稳定性实验 精密吸取同一对照品以及供试品溶液，于1，2，4，8，12和24 h进样10 μL，峰面积的RSD值分别为0.26%和1.32%。结果表明，稳定性良好。

2.1.10准确性实验 精密吸取已知含量的同一供试品溶液1 mL，共9份，分别加入适量毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液，按照2.1.4项下复方供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按照2.1.3项下色谱条件进样分析，平均回收率为97.34%，RSD值为2.07%。结果表明，准确性良好。

2.1.11药材含量测定 取3份黄芪饮片，按照《中国药典》2015年版一部黄芪项下含量测定计算含量，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量为0.433 2%(n=3)，符合药典标准。

毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率=液相测得的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量÷0.433 2%×复方中黄芪药材用量×100%

2.2正交实验安排与结果 见表2和表3。

表2 正交实验结果

Tab.2 The results of orthogonal experiment

实验号因素ABCD干浸膏得率/%毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率/%综合评分1111110.6551.2154.762122216.6070.2277.853133321.6489.63100.004212318.7574.3384.045223121.2458.6275.236231214.6663.4069.847313220.4172.4784.898321315.3161.8169.509332117.3182.8688.71K177.53774.56364.70072.900K276.37074.19383.53377.527K381.03386.18386.70784.513R4.66311.99022.00711.613

表3 毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率方差分析结果

Tab.3 The results of calycosin-7-glucoside transfer rate analysis of variance

因素偏差平方和自由度F比F临界值PA33.33420.17219.000>0.05B278.92121.36019.000<0.05C849.05824.14019.000<0.05D(误差)178.2202

注：F(2,2)0.05=19.00。

综合评分：选择毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率及干浸膏得率的综合评分为指标，权重系数分别为70%和30%。综合评分=(毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率÷毛蕊异黄酮的最大值×0.7+干浸膏得率÷干浸膏得率的最大值×0.3)×100

根据直观分析及方差分析结果可知，3个因素对综合评分的影响大小为 C>B>A，即提取次数>提取时间>加水倍数，因此确定最佳提取工艺为 A3B3C3。

验证实验：为保证优选提取工艺的合理可行，对该工艺进行了3次验证。取1倍处方量药材3份，按照A3B3C3条件提取，测定干膏得率及毛蕊异黄酮葡萄糖苷的转移率，结果显示，干浸膏得率分别为21.15%，20.98%和21.72%，相应的毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率分别为88.79%，89.36%和89.86%。

2.3扶正养肝颗粒的成型工艺

2.3.1剂型的选择 扶正养肝颗粒由11味药组成，临床处方总量为145 g，以水煎汤服用2 d，每日3次，根据最佳提取工艺，计算出每日需服用浸膏质量15～16 g(相当于每次服用生药24 g)。为了与临床保持一致，本方工艺中采用了水提对原料进行处理。因根据本方功能主治特点及适应人群，结合处方中药物成分理化性质，本次研发中选择了颗粒剂。因本症患者多伴有血糖高等症状，故选择制成无糖型颗粒。

2.3.2浓缩、干燥工艺条件 为防止饮片夹带的不溶性杂质对颗粒的溶化性检测产生影响，浓缩前将提取液静置12 h以上，滤过。浓缩工艺选择常规的减压浓缩，温度为60～70 ℃，真空度为0.06～0.08 MPa，相对密度为1.20～1.25 (60 ℃)，以5 000 r·min-1离心20 min，滤过，再常压浓缩至相对密度为1.30～1.35。

干燥工艺条件：干燥工艺采用将辅料与清膏混合干燥，用恒温鼓风干燥的方法，温度控制在65 ℃。

2.3.3辅料评价指标 以制备过程中的软材情况、制粒情况、颗粒情况、颗粒一次收率和溶化性等作为指标对成型工艺进行评价。

颗粒一次收率=通过1号筛但不能通过5号筛的颗粒质量÷颗粒总质量÷整粒前总质量×100%

2.3.4辅料的选择 本方拟制成无糖型颗粒，分别考查了糊精、可溶性淀粉和水溶性淀粉对成型的影响。方法：称取1倍处方量，所得稠膏均分成4份，分别加入30%稠膏量的糊精、麦芽糊精、可溶性淀粉和水溶性淀粉拌膏，平铺在有相应辅料(用量为稠膏量10%)的烘盘中，65 ℃干燥，粉碎，过100目筛，得4份干膏粉，以体积分数为80%的乙醇为润湿剂制成软材，过1号筛制成颗粒，65 ℃干燥，整粒，观察软材情况，干颗粒性状，检查溶化性。结果见表4。

表4 单种辅料考察结果

Tab.4 Inspection results of one excipient

辅料软材情况制粒情况颗粒情况颗粒一次收率/%溶化性糊精适中易制粒棕黑、均匀、硬度适中84.62不合格可溶性淀粉稍黏不易制粒棕黑、均匀、硬度稍硬84.37不合格麦芽糊精黏不易制粒棕黑、均匀、硬度适中76.45合格水溶性淀粉适中易制粒棕黑、均匀、颗粒脆80.58不合格

根据单一辅料考察结果，加入单一辅料后颗粒均不合格，故将不同配比的麦芽糊精和糊精混合，混合辅料与稠浸膏按照1∶0.4的比例混合。方法：称取1倍处方量，将浓缩所得稠膏均分成5份，分别加入30%稠膏量的各比例混合辅料，同法操作。结果见表5。结果表明，选用糊精-麦芽糊精1∶2作为颗粒剂的赋形剂的颗粒一次收率最高。

表5 混合辅料考察结果

Tab.5 Inspection results of mixed excipients

糊精∶麦芽糊精软材情况制粒情况颗粒情况颗粒一次收率/%溶化性1∶1适中易制粒棕黑、均匀、硬度适中85.43不合格1∶2适中易制粒棕黑、均匀、硬度适中86.68合格2∶1适中易制粒棕黑、均匀、硬度适中84.17不合格1∶3稍黏易制粒棕黑、均匀、硬度适中82.72合格3∶1适中易制粒棕黑、均匀、硬度适中82.39合格

2.3.5润湿剂的考察 扶正养肝处方干膏粉的黏性较大，润湿剂可选择不同体积分数的乙醇。称取1倍处方量，将所得稠膏均分成3份，分别加入30%稠膏量的糊精-麦芽糊精(1∶2)拌膏，均匀倒入铺有糊精-麦芽糊精(1∶2，用量为稠膏量10%)的烘盘中，65 ℃干燥，粉碎，过100目筛，得3份干膏粉，以体积分数分别为70%，80%和90%的乙醇为润湿剂制成软材，过1号筛制成颗粒，65 ℃干燥，整粒，观察软材情况和干颗粒性状，检查溶化性。结果见表6。由表6可知，体积分数为80%的乙醇为润湿剂结果最佳。

表6 润湿剂乙醇体积分数考察结果

Tab.6 Inspection results of volume fraction in wetting agents

乙醇体积分数/%软材情况制粒情况颗粒情况颗粒一次收率%溶化性70黏度大不易制粒棕黑、均匀、较硬82.65不合格80适中易制粒棕黑、均匀、硬度适中86.24合格90适中可制粒棕黑、均匀、硬度稍脆82.84合格

2.3.6润湿剂用量的考察 称取1倍处方量，将所得稠膏均分成4份，按照2.3.5项下方法得4份干膏粉，分别加入各份干膏粉总量的10%，15%，20%和25%的体积分数为80%的乙醇制成软材，过1号筛制成颗粒，65 ℃干燥，整粒，观察软材情况和干颗粒性状，检查溶化性。结果见表7。结果表明，润湿剂用量为15%时结果最佳。

表7 润湿剂用量考察结果

Tab.7 Investigation results of dosage in wetting agents

润湿剂用量/%软材情况制粒情况颗粒情况颗粒一次收率/%溶化性10松、散可制粒棕黑、细粉多75.91合格15适中易制粒棕黑、均匀、硬度适中87.63合格20稍黏可制粒深棕黑、均匀、稍硬82.75合格25黏不易制粒深棕黑、颗粒硬71.96合格

2.3.7湿颗粒干燥时间考察 取制备好的湿颗粒1份，平铺于小盘内，厚度1 cm，置于干燥箱内，65 ℃放入鼓风干燥箱，计算1.0，1.5，2.0和2.5 h后颗粒的水分含量，从而确定干燥时间。结果颗粒含水量分别为 7.94%， 6.52%，4.43%和2.74%。干燥2.5 h后，颗粒含水量为2.74%，符合《中国药典》2015年版相关规定，从而确定复方扶正养肝颗粒的干燥时间为2.5 h。

2.3.8颗粒剂流动性的考察 采用固定漏斗法测定休止角，结果显示，休止角均值为32.7°，表明颗粒的流动性良好。

2.3.9颗粒堆密度考察 将颗粒分次倒入10 mL量筒中，边倒边用洗耳球敲打均匀，加至10 mL，倒出，称定质量，平行测3次。计算堆密度：ρ=m÷v。测定结果见表8。结果表明，颗粒的平均堆密度为0.64 g·mL-1。

2.3.10颗粒堆临界相对湿度(CRH)的考查 称取成品颗粒7份，每份2 g，置于干燥器内恒质量24 h，精密称定，又分装于7个已干燥至恒质量的称量瓶中(不加盖)，放入底部分别盛有不同浓度NaOH溶液的干燥器中，25 ℃下恒温保存60 h，精密称定，计算吸湿百分率，实验重复1次，取平均吸湿百分率[13-15]。以相对湿度(RH)为横坐标、吸湿率为纵坐标作图，得CRH，结果显示，成品的CRH为66%，见图2。因此，在分装及贮存时，环境相对湿度控制在68%以下为宜。

图2 不同相对湿度下颗粒的吸湿率

Fig.2 Hygroscopic rates in different RH

2.4工艺验证 按照处方比例称取中药饮片；加10倍量水浸泡60 min后，首次加1.25倍水，煎煮2 h，滤过，同法3次，合并3次滤液，静置过夜，滤过，减压浓缩至相对密度为1.20～1.25 (60 ℃)，以5 000 r·min-1离心20 min，常压浓缩至相对密度为1.30～1.35 (60 ℃)，取稠膏备用，将上述稠膏与30%稠膏量糊精-麦芽糊精(1∶2)拌膏，均匀倒入平铺有糊精-麦芽糊精(1∶2，用量为稠膏量10%)的烘盘中，65 ℃干燥，粉碎，过100目筛，得干膏粉，备用，以15%总干膏粉量的体积分数为80%的乙醇为润湿剂，制备软材，制粒，65 ℃干燥2.5 h，整粒，制得无糖型颗粒，进行外包装。

验证结果表明，按处方比例称取标准处方量饮片2 900 g，按照2.4项下工艺流程进行3次工艺验证，批号分别为20170501，20170502和20170503，结果见表8。实验结果表明，3批样品制备过程中各指标重复性较好，说明所确定的工艺稳定，可用于复方扶正养肝颗粒的生产。

表8 工艺验证结果

Tab.8 Verification of process technology

项目批号201705012017050220170503提取投料量/g2 9002 9002 900提取液毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率/%88.1287.7687.54稠膏质量/g707675721糊精-麦芽糊精总用量/g285268286干颗粒堆密度/g0.650.660.65干颗粒休止角/°30.0531.6031.32干颗粒水分含量/%2.852.792.65颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率/%82.6482.3882.05

3 讨论

本方中黄芪、白芍和土茯苓等主要有效成分为苷类[16]，垂盆草、茵陈和甘草等的主要有效成分为黄酮有机酸类[17]，郁金的主要有效成分为挥发油和多糖[18]，薏苡仁的主要有效成分为多糖、酯类及脂肪酸[19]，丹皮的主要有效成分为丹皮酚及芍药苷，丹参的主要成分为丹酚酸B，这些成分均有较好的水溶性，故整个处方采用水提。

黄芪作为君药，按照《中国药典》2015年版一部规定，应检测黄芪中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，黄芪甲苷用水难以提取，且检测需蒸发光散射检测器，故选用毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为评价指标。

本方成型工艺的原料为稠膏，由于稠膏量较大，干法制粒和稠膏制粒的可行性较小，因此，采用在稠膏中加入部分辅料，拌膏后进行干燥，经多次实验表明，以加入稠膏质量的40%为宜，65 ℃干燥，时间为12 h。