维生素E琥珀酸酯联合化疗药物对乳腺癌增殖的抑制作用

杨睿，时冉冉

（漯河医学高等专科学校，河南 漯河 462000）

0 引言

乳腺癌是一种多发的女性疾病，近年来发病率逐年上升，2012年国家疾控中心的调查结果显示乳腺癌的发病率为42.55%，居女性恶性肿瘤的首位[1]。乳腺癌病因复杂，晚育、酗酒、基因等都是与之相关的因素。化疗是常用的乳腺癌治疗方法，但对身体的副作用大。维生素E琥珀酸酯是一种新型抗癌药物，副作用小，能够诱导癌细胞凋零。本文探究维生素E琥珀酸酯联合化疗药物对乳腺癌增殖的抑制作用，旨在为乳腺癌临床用药提高实验依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料

本实验使用到的材料有维生素E琥珀酸酯（VES）、丝裂霉素(MMC)、环磷酰胺(CTX)、人乳腺癌细胞株Bcap-37，其中维生素E琥珀酸酯的生产厂家为SIGMA公司，丝裂霉素的生产厂家为浙江海正药业股份有限公司，环磷酰胺的生产厂家为上海华联制药有限公司，MTT的生产厂家为AMRESCO,人乳腺癌细胞株Bcap-37购自中科院上海细胞所。

1.2 方法

把Bcap-37细胞置于含10%牛血清的RPMI1640的培养基中培养，环境温度设置为37℃，二氧化碳浓度为5%。用无水乙醇溶解维生素E琥珀酸酯，浓度设置为20μg/mL。溶解CTX、MMC，浓度分别设定为:300μg/mL、3.3μg/mL。把人乳腺癌细胞株 Bcap-37分为3组，分别加入维生素E琥珀酸酯、环磷酰胺及丝裂霉素，作用24h、36h后观察Bcap-37的生长状况[2]。并设置一组不加任何药物的含人乳腺癌细胞株Bcap-37的培养基作为对照组。

1.3 检测项目及方法

1.3.1 乳腺癌细胞增殖检测

接种人乳腺癌细胞株Bcap-37，将其置于96孔板上，每个孔注入浓度为2×104/mL的Bcap-37细胞株200μL，此外，每组设置6个复孔。细胞接种后24h在孔板上加入不同浓度的VES、CTX及MMC进行药物处理，之后再加入浓度为5g/L的MTT，每个孔中加入20μL。孵箱温度保持在37℃，培养4h之后除去孔中的上清液，再加入DMSO，每孔加入150μL。之后把孔板置于震荡台上震荡5min，使用自动酶标仪进行比色，并测定细胞的吸光值A（492nm）。最后通过吸光值测定出不同浓度、种类的药物对Bcap-37细胞的生长抑制率[3]。计算公式为:抑制率（%）=（对照组平均吸光值A-实验组平均吸光值A）/对照组平均吸光值A×100%。

1.3.2 流式细胞仪分析细胞周期

把Bcap-37细胞接种于6孔板上，细胞浓度为5×104。并加入 20μg/mLVES 和 3.3μg/mL 的 MMC，或者是 20μg/mLVES的 300μg/mLCTX，作用 24h后，将培养液离心处理，去除培养液，制成细胞悬浊液。并在悬浊液中加入70%冰乙醇，之后再加入PI，温度保持在4℃，置于黑暗处30min。并设置未经药物处理的细胞作为对照。最后将细胞悬浊液进行上机分析，每个标本设置为10000个细胞，分析细胞凋亡率和细胞周期。

1.3.3 流式细胞仪检测细胞表面Fas表达

把Bcap-37细胞接种于6孔板上，细胞浓度为5×104。并加入 20μg/mLVES 和 3.3μg/mL 的 MMC，或者是 20μg/mLVES的 300μg/mLCTX，作用 24h后，将培养液离心处理，去除培养液，制成细胞悬浊液。之后在细胞悬浊液中加入PE标记的FAS抗体静置30min，并使用PBS漂洗3次[4]，最后使用流式细胞仪检测荧光强度。

1.4 统计学方法

采取SPSS 20.0统计学软件对本文数据进行分析处理，计数资料用n、%表示，组间比较采用t、χ2检验，当差异具有统计学意义时，P＜0.05。

2 结果

2.1 VES与化疗药物联合对与乳腺癌细胞的生长抑制作用

单一使用VES、MMC、CTX对乳腺癌细胞生长的抑制作用在24、36h内分别为:38.47%、52.73%；59.06%、64.25%；28.85%、46.91%。VES与 化 疗 药物联合使用对乳腺癌细胞的生长抑制作用明显增强，分别为76.70%、90.14%；64.13%、80.88%。与使用单一药物相比，明显增强，具有统计学意义，P＜0.05（与MMC相比作用不显著）。

2.2 VES与化疗药物联合对癌细胞凋亡率的影响

Bcap-37细胞的自然凋亡率为0.7%，单独使用VES、MMC、CTX时Bcap-37细胞的凋亡率在24h内分别为:19.2%、16.7%、12.3%。VES与化疗药物MMC、CTX联合使用时，Bcap-37细胞的凋亡率在24h内分别提高到4.8%、39.6%。

2.3 乳腺癌细胞表面Fas表达受VES联合化疗药物的影响

对照组的乳腺癌细胞表面Fas表达平均荧光强度和阳性率分别为4.09、92.5%。经VES与化疗药物MMC、CTX联合处理后，其平均荧光强度和阳性率分别为:22.0、100%；18.7、100%。

表1 VES、MMC、CTX单独使用与联合作用与癌细胞A值、抑制率的关系

3 讨论

乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，发病率高，占女性肿瘤发病率的31%，严重威胁着女性的健康，常用的治疗方法有药物治疗和手术治疗。研究表明[5]，化疗药物联合使用对乳腺癌细胞的抑制作用增强。医学界常常使用引用新药物的办法来提高化疗的有效性，维生素E琥珀酸酯是一种新型药物。Turley等人发现维生素E琥珀酸酯能够产生诱导效应，使淋巴瘤细胞凋亡。随后人们对其开始了广泛的研究，发现它不仅仅能使淋巴瘤细胞凋亡，对胃癌、前列腺癌、乳腺癌等上皮组织来源的恶心肿瘤都有十分有效的诱导凋亡作用。常用的化疗药物副作用大，会对人体造成较大伤害，尤其是对身体虚弱的癌症患者而言，使用化疗药物是具有一定危险性的。维生素E琥珀酸酯是维生素E的一种衍生物，具有毒副作用小的效果，其发现提高了化疗治疗乳腺癌的用药安全性。

本文设置了两个对照，不加任何化学药物的乳腺癌细胞培养基，和加了常用化疗药物丝裂霉素和环磷酰胺的细胞培养基。用于对比单独用药和联合维生素E琥珀酸酯用药的效果。结果表明:VES、MMC、CTX联合使用能够调控细比使用单一药物相比对乳腺癌细胞的抑制作用更明显，具有统计学意义，P＜0.05。为何联合用药效果更好，猜想维生素E琥珀酸酯在抑制乳腺癌细胞的过程中与MMC、CTX产生了协同作用。已知Fas/FasL是癌细胞死亡的三大因子之一，在诱导癌细胞凋零的过程中起到了重要的作用。从流式细胞分析仪的分析结果来看，VES能够调控Fas/FasL促使癌细胞凋亡，且VES联合用药后Fas的平均荧光强度和阳性率从4.09、92.5%提高到了22.0、100%；18.7、100%，Fas表达增强。综上，VES、MMC、CTX联合使用能够增强乳腺癌细胞Fas的表达，抑制其生长。