CIK细胞对肝癌细胞株HEP-G2体外杀伤作用及杀伤机制研究

龚小波 杨大刚△ 孙诚谊 王惠群 刘影

(1.贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳 550004 ；2.贵州医科大学，贵州 贵阳 550004)

肝癌是当前严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤，占全球新发现癌症的5.4%，其死亡率高，我国肝癌死亡率仅次于肺癌居第二位[1]。目前，肝癌以手术切除结合放疗及化疗的综合治疗为主。虽然综合治疗将肝癌的5年生存率提高了近15%，但总体仍未超过30%[2]。随着肿瘤免疫学的不断进展，肿瘤免疫治疗已经成为继手术和放、化疗之后第四种肿瘤治疗的手段，并且有望成为最终攻克肿瘤的方向[3]。本实验通过研究CIK细胞在体外对肝癌细胞株HEP-G2的杀伤作用及杀伤机制，为肝癌的细胞免疫治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1试剂及仪器 DMEM高糖培养基、PRMI-1640培养基、PBS缓冲液(美国Hyclone公司)；GT-T551无血清培养基(北京宝日医生物技术公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；淋巴细胞分离液(挪威Axis-shield公司)；IFN-γ、IL-1α、CD3McAb、IL-2(美国Peprotech公司)；台盼蓝染液、二甲基亚砜(DMSO)、辣根过氧化物酶(HRP)偶联羊抗兔(二抗)(贵州鼎国生物技术公司)；CD3-ECD、CD8-PE、CD56-FITC、CD69-PE、HLA-DR-FITC(美国Beckman CoμLter 公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)(贵州赛兰博科技公司)；JC-1试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、兔β-actin(上海碧云天生物技术公司)；PVDF膜、ECL反应试剂盒(美国Amersham公司)；兔抗人Caspase-3(一抗)(北京博奥森生物技术公司)。CO2培养箱、生物安全柜、低温离心机(美国Thermo公司)、多功能酶标仪(美国Bio-tek公司)；流式细胞仪(美国Beckman CoμLter 公司)；Western blot电泳及转印设备(美国Bio-rad公司)；荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.2细胞获取及培养 肝癌细胞株HEP-G2来自于贵州医科大学附属医院肝胆外科液氮长期保存。在含10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。CIK细胞制备：CIK细胞由贵阳医学院附属医院肿瘤生物治疗中心制备。健康志愿者外周血经淋巴细胞分离液分离，分离后的外周血单个核细胞(PBMC)用含0.6%自体血清的GT-T551培养基调至起始密度为2.0×106/L。于第0天加入IFN-γ 1 000 U/mL，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，24 h后加入IL-1α 100 U/mL，CD3McAb 50 ng/mL，IL-2 1 000 U/mL继续培养。以后根据培养情况添加含IL-2 1 000 U/mL的GT-T551培养基，并调整细胞密度为2.0×106/mL。CIK细胞培养至14 d，取少许培养细胞做流式细胞仪检测。

1.3CIK细胞增殖及免疫表型检测 培养第1、4、7、10、14 d时用台盼蓝染液计数CIK细胞数，并计算增殖倍数。流式细胞仪检测CD3、CD56、CD8、CD69及HLA-DR的表达情况以表征CIK细胞的免疫表型及活化程度。

1.4CIK细胞杀瘤活性测定

1.4.1MTT法检测CIK细胞对HEP-G2细胞杀伤活性 将HEP-G2细胞作为靶细胞按20×104/mL加入96孔板，每孔100 μL细胞悬液。12 h后按照效靶比1∶1、2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1加入CIK细胞，另设单独HEP-G2细胞组和单独CIK细胞组。每组均设3个复孔，37 ℃、5%CO2培养箱中各培养24、48、72 h。取出孔板振荡，弃上清，PBS 100 μL洗板2次，1640培养基100 μL/孔，MTT(5 mg/mL)20 μL/孔，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 h。取出孔板1 000 rpm离心5 min，弃上清，DMSO 200 μL/孔，振荡溶解10 min，用酶标仪490 nm，测OD值，计算CIK杀瘤活性。杀伤率(%)=[1-(实验组OD值-单独CIK细胞组OD值)/单独HEP-G2细胞组OD值]×100%。

1.4.2JC-1荧光染色检测CIK细胞对HEP-G2细胞杀伤活性 将HEP-G2细胞作为靶细胞按130×104/mL加入6孔板，每孔1.5 mL细胞悬液。12 h后按照效靶比1∶1、5∶1、10∶1、20∶1加入CIK细胞，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。然后取出6孔板振荡，弃上清，PBS 2 mL/孔洗板2次，1640培养液1 mL/孔、JC-1工作液1 mL/孔，37 ℃、5% CO2培养箱中培养20 min。取出孔板弃上清，JC-1缓冲液1 mL/孔洗板2次，1640培养基2 mL/孔，荧光显微镜下观察。

1.5HEP-G2细胞中Caspase-3蛋白的表达情况 将HEP-G2细胞作为靶细胞按45×104/mL加入6孔板中4孔(A、B、C、D)，12h后按效靶比1∶1、5∶1、10∶1、20∶1加入CIK细胞，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。收集并裂解细胞，提取总蛋白，用BCA试剂测蛋白含量。等量蛋白质采用120 g/L十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，然后转至PVDF膜上，用封闭液4 ℃封闭过夜，加入兔抗人Caspase-3抗体(1∶200)，室温孵育2 h，室温下洗膜后加入相应辣根过氧化物酶(HRP)耦联羊抗兔2抗，室温孵育1 h，ECL显影。以β-actin条带作为内对照。

2 结 果

2.1细胞增殖及免疫表型检测

2.1.1细胞增殖的动态观察 见图1，CIK细胞在第1～7天增殖比较缓慢，第7天以后增殖速度加快，第14天细胞增殖约100倍，细胞数为(9 611±961)×106个。细胞活率保持在97%以上。

图1 CIK细胞增殖情况

2.1.2CIK细胞免疫表型变化 见图2，CD3+CD8+及CD3+CD56+的比例随培养时间的增加逐渐增高。培养第14天时，CD3+CD8+和CD3+CD56+比例分别达到(71.37±3.68)%和(23.93±4.20)%。

图2 CIK细胞免疫表型变化

2.1.3CIK细胞活化情况 见图3，T细胞活化标志HLA-DR的表达率随培养时间的增加而增高。培养第14 d时，T细胞活化标志HLA-DR的表达率达到93.45%，已具备活化的淋巴细胞功能。

图3 CIK细胞活化情况

2.2MTT法检测CIK细胞对HEP-G2细胞杀伤活性 CIK细胞在体外对肝癌细胞株HEP-G2具有杀伤作用，并且随着CIK细胞剂量及作用时间的增加，杀伤率增加(P<0.05)。效靶细胞作用24 h时，效靶比20∶1杀伤率与效靶比10∶1差异无统计学意义(P>0.05)。效靶细胞作用48 h时，效靶比20∶1杀伤率与效靶比10∶1差异有统计学意义(P<0.05)。效靶细胞作用72 h时，效靶比20∶1杀伤率与效靶比10∶1差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同效靶细胞作用一定时间的杀伤率

注：与1∶1比较，△P<0.05，▲P<0.01；与2.5∶1比较，○P<0.05，●P<0.01；与5∶1比较，☆P<0.05，★P<0.01；与10∶1比较，◆P<0.01。与24 h比较，*P<0.05，&P<0.01；与48 h比较，#P<0.05。

2.3JC-1荧光染色检测CIK细胞对HEP-G2细胞杀伤活性 图4是不同效靶比的JC-1荧光图。如图所示：效靶比1∶1、5∶1、10∶1、20∶1作用24 h后，利用JC-1荧光染色检测CIK细胞对HEP-G2细胞杀伤活性，绿色荧光表示HEP-G2细胞已经处于早期凋亡。

2.4Western blot法检测肝癌细胞株HEP-G2中Caspase-3蛋白的表达 见表2，效靶比为1∶1时，凋亡蛋白Caspase-3的表达高于效靶比5∶1(P<0.05)。效靶比为20∶1、10∶1时，凋亡蛋白Caspase-3的表达均高于效靶比5∶1、1∶1(P<0.05)。见图5，与CIK细胞共孵育的HEP-G2细胞在32 kD处出现明显蛋白条带，与所染Caspase-3一抗目的蛋白分子量相同。

表2 Caspase-3蛋白与β-actin总灰度值及不同效靶比组蛋白相对表达量的比较

注：与1∶1比较，*P<0.05。与5∶1比较，#P<0.05。

图5 不同效靶比组Caspase-3蛋白的表达胶片

3 讨 论

CIK细胞(多种细胞因子诱导的杀伤细胞)同时表达CD3+CD56+CD8+膜蛋白分子，又称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点；具有广谱肿瘤杀伤性，对多种肿瘤细胞均表现强大的杀伤活性，对多重耐药肿瘤细胞也具有杀伤活性，更加安全可靠、无毒副作用[4-6]。本研究培养的CIK细胞，经过14 d的扩增培养后，CD3+CD8+细胞比例提高2.24倍，CD3+CD56+细胞比例提高5.12倍，活化T细胞比例提高10.11倍，达到93.45%。表明培养细胞具备典型CIK细胞表型，并高度活化。

本研究结果显示：(1)效靶细胞作用相同时间时，效靶比20∶1组与其它效靶比组相比，CIK细胞对肝癌细胞株HEP-G2有明显杀伤作用。(2)效靶细胞作用48 h时，效靶比20∶1组与效靶比10∶1组在CIK细胞对肝癌细胞株HEP-G2的杀伤率上有差异。但作用24 h时，效靶比20∶1组与效靶比10∶1组杀伤率却未发现差异。这是因为效靶细胞作用24 h时，CIK细胞对肝癌细胞株HEP-G2作用时间不足，杀伤作用不能完全体现。效靶细胞作用72h时，效靶比20∶1组与效靶比10∶1组杀伤率同样未发现差异。这是因为CIK细胞、肝癌细胞株HEP-G2消耗培养基及细胞自身的凋亡，使得此时的杀伤率较效靶细胞作用48 h时的杀伤率增加幅度不大。此结果间接验证了临床回输CIK细胞到人体的时间即间隔48 h回输人体，1周为1疗程。本研究还显示，效靶细胞互相作用24 h后，当效靶比为1∶1时，JC-1荧光染色检测到肝癌细胞株HEP-G2剩余的细胞数量最多，且肝癌细胞株HEP-G2呈红色荧光的细胞数量均明显多于其他效靶比组。当效靶比为20∶1时，肝癌细胞株HEP-G2剩余的细胞数量最少。

CIK细胞杀伤肿瘤细胞的机制并不十分明确，目前公认的：(1)CIK细胞释放胞浆颗粒进入肝癌细胞外间隔，通过颗粒内含物发挥对靶细胞的直接杀伤作用。(2)CIK细胞可以释放大量炎性细胞因子如IL-4、IL-2、IFN-γ、GM-CSF、TNF-a等，这些细胞因子不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可以通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞[7]。(3)CIK细胞高水平表达Bcl-2、Bcl-xL、DADI、survivin等抗凋亡基因，这些基因共同导致CIK细胞可以耐受表达FasL(CD178)的肝癌细胞诱导的凋亡。CIK细胞也可以通过Fas/FasL途径诱导凋亡机制，从而对其进行有效的杀伤[8]。Fas(CD95)作为一种普遍表达的受体分子，可以出现在多种细胞表面。FasL的大量表达只见于活化的T细胞和NK细胞。Fas和FasL的配接以三聚体的形式出现。3个Fas分子胞内段所带有的死亡结构域(DD)相聚成簇，招募了胞浆中另一种带有死亡结构域的衔接蛋白(FADD)。FADD以其DED(死亡效应结构域)连接另一个带有DED的后续成分称为Caspase8前体。Caspase8前体属于酶原，激活后称为Caspase8。Caspase8使Caspase3酶原转化为具有活性的Caspase3，从而引发Caspase介导的级联反应[9]，诱导细胞的凋亡。

本研究发现，CIK细胞、HEP-G2细胞按照效靶比20∶1、10∶1、5∶1、1∶1在互相作用24 h后，均有凋亡蛋白Caspase-3的表达。其中，效靶比为20∶1、10∶1时，凋亡蛋白Caspase-3的表达均明显高于效靶比5∶1、1∶1，表明在杀伤过程中CIK细胞的增加能导致凋亡蛋白Caspase-3的表达增多，诱导肝癌细胞凋亡的作用增强。但效靶比为1∶1(24 h)时，凋亡蛋白Caspase-3的表达高于效靶比5∶1。因此考虑效靶比5∶1比效靶比1∶1消耗的培养基相对较多，而效靶比5∶1组中的CIK细胞数量少于效靶比20∶1、10∶1组中的CIK细胞数量，故效靶比5∶1组中的CIK细胞既消耗了培养基、数量又不足，所以不能有效地诱导肝癌细胞HEP-G2的凋亡。

综上，CIK细胞在体外对肝癌细胞株HEP-G2有明显杀伤作用。杀伤机制有可能是通过Fas/FasL凋亡途径，启动凋亡蛋白Caspase介导的级联反应，诱导下游凋亡蛋白Caspase-3的表达，从而引起肝癌细胞株HEP-G2的凋亡。