TLR4/MyD88介导的炎症反应在体外培养癫痫海马组织中的作用研究

叶洁梅， 黄国雄， 黄媛恒

癫痫是神经系统的常见病。近年来，癫痫与免疫相关的学说渐渐倍受关注，异常免疫反应可能是痫性发作和癫痫形成的始动因素之一，小胶质细胞、星型胶质细胞和神经元可作为免疫活性细胞，参与和影响炎症反应。天然免疫受体Toll样受体家族(Toll-like receptors,TLRs)是连接先天免疫和适应性免疫的桥梁，TLR4(toll-like receptor 4)作为TLRs家族的一名重要成员，是神经元、星型胶质细胞、小胶质细胞的炎性受体，可以促进免疫调控分子和细胞因子表达，影响癫痫的发生和进展，具体作用尚不十分清楚[1]。本研究拟体外观察大鼠海马癫痫组织中细胞TLR4介导的炎症效应和作用通路，进一步阐明癫痫发病中的炎症机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料和仪器 新生6～9 d SD鼠由广西医科大学实验动物中心提供，雌雄不限。HBSS购于Sigma公司，总RNA提取试剂盒购于Invitrogen，SYBR Green Supermix试剂盒购于Bio-Rad公司，逆转录试剂盒购于Promega公司，Anti-MyD88购于Bioss公司，TLR4 Polyclonal Antibody购于Abbkine公司，Western blotting DAB显色试剂盒购于Solarbio公司。实时定量PCR仪购于Bio-Rad公司。

1.2 研究方法

1.2.1 体外自发性癫痫样放电海马脑片模型制备 无菌条件下分离出新生6～9 d SD鼠的完整海马，置于4 ℃HBSS液中，在振动切片机的载物平台上，以400 μm厚度进行切片。随后将海马脑片放在6孔培养板各孔内的滤膜上，各孔内分别加入1.3～1.5 ml的完全培养基，置37 ℃、5%CO2条件下培养，每周半量更换培养液两次，倒置相差显微镜下观察生长情况，培养至7 d。人工脑脊液(ACSF)成分(mmol/L)：NaCI 124、KCI 3.3、KH2PO41.2、NaHCO326、CaCl22.5、MgSO42.4、葡萄糖10，pH 7.4。脑片在ACSF中通95%O2及5%CO2孵育至少1 h，实验时改用未加Mg2+ACSF(即无Mg2+ACSF)灌流3 h，制备自发性癫痫样放电海马脑片模型，于造模前和造模后1 d、3 d、1 w各时点收集样品进行检测。

1.2.2 Real-time PCR检测TLR4、MyD88、IL-1β、IL-6基因 于造模前和造模后1 d、3 d、1 w各个时间点收取组织标本，冰上碾磨，提取海马组织总RNA，紫外分光光度计鉴定纯度，根据逆转录试剂盒合成cDNA。用SYBR Green核酸荧光染料，根据试剂盒说明书操作，进行40个PCR循环后分析结果，采用公式2-△△CT计算各目的基因mRNA的表达水平。每个样品均设3个复孔，实验重复3次。

1.2.3 Western blot检测TLR4和信号蛋白MyD88的表达 于造模前后1 d、3 d、1 w各时点，采用蛋白提取试剂盒按说明书操作提取总蛋白，测定蛋白浓度后煮沸变性，SDS-PAGE 凝胶电泳，70 V电转4 h至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，分别加入稀释后的待检测的蛋白单克隆抗体，4 ℃过夜，洗膜3次，每次10 min，加入相应二抗，室温1 h，洗膜3次，每次10 min，显色曝光，分析TLR4和MyD88的表达水平。

2 结 果

2.1 大鼠正常海马组织和癫痫样放电海马脑片中TLR4 mRNA和蛋白的比较 和造模前大鼠正常海马组织对照组相比，造模后1 d、3 d、1 w大鼠癫痫样放电海马脑片中TLR4 mRNA的相对表达水平均明显增高(P<0.001)，TLR4 蛋白的表达水平也均明显增高(P<0.001)(见图1A、1B)。

2.2 大鼠正常海马组织和癫痫样放电海马脑片中MyD88 mRNA和蛋白的比较 和造模前大鼠正常海马组织对照组相比，造模后1 d、3 d、1 w癫痫样放电海马脑片中各时间点实验组MyD88 mRNA的相对表达水平均明显增高(P<0.001)，MyD88蛋白的表达水平也均明显增高(P<0.001)(见图2A、2B)。

2.3 大鼠正常海马组织和癫痫样放电海马脑片中IL-1β和IL-6 mRNA的比较 和造模前大鼠正常海马组织对照组相比，造模后1 d、3 d、1 w癫痫样放电海马脑片中各时间点实验组IL-1β和IL-6 mRNA的相对表达水平均明显增高(P<0.001)(见图3A、3B)。

(注：***P<0.001)

图1 A：大鼠正常海马组织和癫痫样放电海马中TLR4 mRNA水平；B：大鼠正常海马组织和癫痫样放电海马中TLR4蛋白表达

(注：***P<0.001)

图2 A：大鼠正常海马组织和癫痫样放电海马中MyD88 mRNA水平；B：大鼠正常海马组织和癫痫样放电海马中MyD88蛋白表达

(注：***P<0.001) (注：***P<0.001) 图3 A：大鼠正常海马组织和癫痫样放电海马中IL-1β mRNA水平；B：大鼠正常海马组织和癫痫样放电海马中IL-1β蛋白表达

3 讨 论

癫痫是神经系统的常见病，流行病学调查显示其发病率为5‰～7‰。由于血脑屏障的存在及脑内缺乏淋巴系统，中枢神经系统曾被认为是免疫豁免的场所，癫痫曾被认为是非炎症性病变。近年来，大量临床和实验研究证据表明，脑部炎症反应是痫性发作和癫痫形成的重要机制之一，癫痫发作后快速诱导的炎症反应，包括神经元、胶质细胞和外周免疫细胞的活化以及炎症细胞因子的分泌，同时，炎症也可诱导癫痫发作，促进其病理进程，并导致海马发生病理性改变，例如局部神经元损伤凋亡、胶质细胞修复再生等[1～3]。

TLRs家族中的TLR4可被体内受损细胞释放的内源性配体如热休克蛋白、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、高迁移率组蛋白1 (high mobility group box 1 protein，HMGB1)激活，发挥转录调控作用[4]。MyD88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是TLR4的胞内接头蛋白，具有募集下游信号分子的N端死亡结构域(Death domain，DD)和承接TLRs活化信号的C端TIR结构域。TLR4与细胞内源性配体激活后，通过C端TIR结构域募集MyD88样接头蛋白MAL(MyD88 adaptor like protein，MAL)和MyD88，与IRAK(IL-1 receptor-associated kinase，IRAK) 家族分子结合成为信号转导复合物，随后后者磷酸化从MyD88/IRAK复合体脱离，激活接头蛋白TNF受体相关因子(TNFR-associationfactor-6,TRAF-6)，促使NF-κB由胞浆转移到核内，发挥转录调控作用，激活 IL-1β、IL-8、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，Cox-2)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、补体、趋化因子等基因，最终导致炎症因子释放[5,6]。

TLR4在脑组织中主要表达于星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元。目前国内外关于TLR4及其信号通路与癫痫关系的研究较少。Das等[7]在大鼠出生后2 w给予注射LPS后发现激活的TLR4可以诱发炎症反应，并且这些大鼠成年后对癫痫的易感性增加。Rodger等[8]对大鼠脑皮质进行研究后发现，当LPS与TLR4 结合后可引发局部癫痫样放电。Maroso等[9]发现TLR4在海人藻酸致痫小鼠的CA1、CA3、DG 区星形胶质细胞和神经元上表达增多，TLR4基因敲除或TLR4拮抗剂处理后小鼠痫性发作减轻。体外培养新生SD大鼠海马神经元无镁细胞外液所致难治性癫痫模型中TLR4蛋白及mRNA增高，且随时间的延长而增强[10]。本实验结果显示，模型组大鼠癫痫样放电海马组织中，TLR4和MyD88的mRNA和蛋白的均不同程度的升高，炎性因子IL-1β和IL-8 mRNA升高，表明TLR4/MyD88信号通路在癫痫发病和进展的炎症反应中起重要作用。

综上所述，本研究表明，癫痫海马内细胞表面表达的TLR4可作为重要的受体，通过MyD88介导神经炎性损伤，可能是癫痫形成的异常免疫机制之一，免疫调节和抗炎治疗可能是癫痫治疗的新靶点。