乳腺癌组织中Livin和Smac的表达及其临床意义*

徐聂，李昌林，肖敏伟，侯梅

乳腺癌目前全球发病率逐渐升高，但治疗效果较好，其5年生存率已从1975年的30%增长到2005年的90%[1-2]。目前学者多关注于乳腺癌的ER、PR、Her-2等基因的表达情况，但近年来研究凋亡相关基因在乳腺癌发病机制中的作用，有可能成为乳腺癌治疗的新策略。

目前已发现人体内存在抗凋亡基因和促凋亡基因。Livin是一种凋亡抑制蛋白，能抑制细胞凋亡，其组织分布也具有明显的细胞选择性，已经发现其在多种肿瘤细胞中表达异常，而在正常成人组织中无表达或低表达[3]。Smac(second mitochondria-derived activator of caspase)则是一种线粒体膜间隙蛋白；在细胞凋亡中，Smac通过解除凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)对半胱氨酸蛋白酶caspase的抑制而发挥促凋亡作用[4]。

目前，Livin与Smac在人乳腺癌及癌旁组织中的表达情况少见报道，本研究采用免疫组化S-P法检测乳腺癌组织中Livin与Smac的表达情况，分析其临床病理学意义和相互关系，为乳腺癌治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

试验组(乳腺癌组织)：收集华西医院2004年1月～2004年12月手术切除的临床各期乳腺癌患者石蜡标本43例。

入组标准：1.接受乳腺癌根治性切除术(包含淋巴结清扫)，术后病理证实为乳腺癌(包括浸润性导管癌和非浸润性导管癌)；手术标准达到R0切除，无远处转移；2.术前均未进行放化疗及内分泌治疗；3.患者未伴发其他恶性肿瘤、免疫系统疾病、严重创伤、炎症感染、糖尿病及心血管合并症。对照组(乳腺癌旁组织)：纳入研究的乳腺癌患者对应乳腺癌旁组织。 所有患者采用电话随访获取随访信息，以手术日期为随访开始时间，2010年1月1日为随访截止时间。如乳腺癌5年内复发视为终点事件，5年内未复发视为截尾数据。

1.2 试剂

一抗兔抗人Livin多克隆抗体，工作浓度1 ∶100，购于美国Santa生物技术公司；一抗兔抗人Smac多克隆抗体，工作浓度1 ∶300，购于北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 实验方法

采用S-P法，包括二甲苯脱蜡2次、3%过氧化氢避光处理以阻断内源性的过氧化氢酶、抗原热修复处理；PBS液(磷酸盐平衡生理盐水)冲洗、滴加生物素标记抗体稀释，DAB染色液显色，中性树胶封片等步骤。

1.4 结果判定

Livin和Smac蛋白采用免疫组织化学S-P法，染色阳性表现为黄色或棕色颗粒，表达于细胞浆中。采用半定量积分法[5]，对每张切片的阳性细胞率及着色强度进行分级记分。在400倍镜下选取5个视野，计数Livin和Smac蛋白阳性表达细胞所占百分率。阳性细胞率<5%记为0分，5%～25%记为1分，26%～50%记为2分，>50%记为3分；着色强度：基本不着色的记为0分，淡黄色的记为1分，棕黄色的记为2分，棕褐色的记为3分。每个视野染色强度与阳性细胞率所得分数相乘为每个视野的得分，最后得分为5个视野分数的平均值。0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～6分为中等阳性(++)，6分以上为强阳性(+++)。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析处理，Livin与Smac蛋白在乳腺癌组织及乳腺癌旁组织之间的表达率情况，以及Livin和Smac的表达情况与不同临床病理特征之间的关系采用χ2检验；Livin与Smac在乳腺癌中表达的相关性用Spearman相关性检验；患者生存情况用 Kaplan-Meier曲线方法进行分析，无病生存率的比较采用log-rank检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

本研究43例患者中年龄最小的为34岁，最大的为76岁，中位年龄55.4岁；浸润性导管癌31 例，非浸润性导管癌12例(导管内癌8 例，粘液癌4例)；按照2002年AJCC乳腺癌分期标准，Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期32例；有淋巴结转移29例，无淋巴结转移(N0)14例；受体三阴性患者13例，非三阴性患者30例；死亡5人，存活38人，5年生存率为88.4%。

2.1 Livin蛋白的表达情况

43例乳腺癌组织中Livin表达的阳性率79.1% (34/43) 明显高于癌旁组织48.8% (21/43)，差异有统计学意义(χ2=8.524，P<0.01)(图1)。

图1 Livin和Smac蛋白在切片中的染色情况

Figure 1. Expression of Livin and Smac in Breast Cancer

A.ExpressionofLivininbreastcancertissue,theredarrowindicatesthepositiveexpressionofLivininthecytoplasmofcancercells(40×10);B.ExpressionofSmacinparacarcinomatissue,theredarrowindicatesthepositiveexpressionofLivininthecytoplasmofparacarcinomacells(40×10);C.NegativeexpressionofLivininparacarcinomatissue;D.NegativeexpressionofLivininbreastcancertissue.

进一步分析Livin蛋白的表达与乳腺癌不同临床指标之间的关系，采用χ2检验，Livin的表达与乳腺癌的组织病理学类型、TNM分期及淋巴结转移情况差异有统计学意义，而与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、胸壁侵犯、受体情况及5年生存期差异无统计学意义(表1)。

表1 Livin蛋白的表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系

Table 1. Correlation between the Livin Expression and Clinicopathologic Features of Breast Cancer

VariableNLivin positive (n) -++++++Positive case(n)Positive rate(%)χ2PAge (year)0.0310.860 <551845811477.8 ≥5525512712080.0

(Table 1 continues on next page)

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VariableNLivin positive (n) -++++++Positive case(n)Positive rate(%)χ2PTumor size1.6400.200 ≤2cm1654701168.8 >2cm27413822385.2Pathological type4.3250.038 Invasive ductal carcinoma314151022787.1 Non-invasive ductal carcinoma125250758.3Chest wall invasion0.6480.421 Yes103340770.0 No336141122781.8TNM stage5.3720.020 Ⅰ～Ⅱ115321654.5 Ⅲ～Ⅳ324141312887.5Lymphnode metastasis6.0310.014 Yes293151012689.7 No146251857.1Receptor0.0520.820 Triple-negative1336221076.9 Non triple-negative306111302480.0Survival0.0030.957 ≤5 years51121480.0 >5 years388161313078.9

2.2 Smac蛋白的表达情况

Smac蛋白与Livin类似，也在细胞质内表达，43例乳腺癌组织中Smac表达的阳性率74.4%(32/43) 明显低于癌旁组织93.0%(40/43)，差异有统计学意义(χ2=5.460，P<0.05)。

同样，深入分析Smac蛋白的表达与乳腺癌不同临床特征的之间的关系，经χ2检验，Smac的表达与乳腺癌的TNM分期及淋巴结转移情况差异有统计学意义，而与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、病理学类型、浸润深度、受体情况及5年生存期差异无统计学意义(表2)。

表2 Smac蛋白的表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系

Table 2. Correlation between the Smac Expression and Clinicopathologic Features of Breast Cancer

VariableNSmac positive (n) -++++++Positive case(n)Positive rate(%)χ2PAge (year)0.0780.779 <551857601372.2 ≥5525615131976.0Tumor size0.6250.429 ≤2cm1636521381.3 >2cm27816211970.4Pathological type0.5250.469 Invasive ductal carcinoma31720222477.4 Non-invasive ductal carcinoma124251866.7Chest wall invasion0.2310.644 Yes102440880.0 No33918332472.7TNM stage11.2440.001 Ⅰ～Ⅱ117031436.4 Ⅲ～Ⅳ32422422887.5

(Table 2 continues on next page)

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VariableNSmac positive (n) -++++++Positive case(n)Positive rate(%)χ2PLymphnode metastasis4.3290.037 Yes281010511664.3 No15112221493.3Receptor0.0610.804 Triple-negative1335321076.9 Non triple-negative30817412273.3Survival0.6180.432 ≤5 years52120360.0 >5 years38921532976.3

2.3 Livin及Smac蛋白表达的相互关系

采用Spearman相关性检验，分析乳腺癌中Livin及Smac的阳性表达情况(见表3)，发现两者之间呈负相关，r=-0.302,P<0.05。

表3 乳腺癌组织中Livin和Smac表达的相关性

Table 3. Correlation between Livin and Smac Expression in Breast Cancer

VariableLivinSmac-++++++-0290+21131++7140+++0111r-0.302P0.049

2.4 生存分析

43例患者均采用电话随访获取随访信息，以手术日期为随访开始时间，无失访病例，所有患者随访时间均≥60个月。随访截止时间为2010年1月1日；其中29例5年内出现复发。无病生存期指从手术后的第一天开始至第一次复发或转移的时间。Livin蛋白阴性组中有3例出现复发，5年无病生存率为66.7%；阳性组中有26例出现复发，5年无病生存率为23.5%，经Kaplan-Meier生存曲线分析发现，Livin阴性表达组比阳性表达组术后5年无病生存率高，进行Log-rank检验发现其差异具有统计学意义(χ2=5.527，P<0.05)(图2)。而Smac阴性组中有6例出现复发，5年无病生存率为58.2%；阳性组中有23例出现复发，无病生存率为28.1%，经Kaplan-Meier生存曲线分析发现，Smac阴性表达组与阳性表达组之间术后5年无病生存率差异无统计学意义(χ2=1.529，P>0.05)(见图2)。

图2 Livin与Smac蛋白表达差异者的Kaplan-Meier生存曲线

Figure 2. Kaplan-Meier Survival Curve of Patients with Different Livin and Smac Expressions

A.Livinexpressionbetweenthenegativegroupandthepositivegroup;B.Smacexpressionbetweenthenegativegroupandthepositivegroup.

3 讨 论

细胞凋亡是目前细胞死亡研究的热门领域。当凋亡调控失衡时，就会导致疾病发生[6]。抑凋亡基因IAPs家族具有明显的抗细胞凋亡能力，近年来引起了学者的广泛关注[7]。众所周知，IAP蛋白过表达能使肿瘤细胞积聚，并增加肿瘤的耐药性[8]。IAPs家族由8种蛋白所组成，其中Livin是目前抗凋亡活性最强的一种，最初是从黑色素瘤细胞中发现，在多种肿瘤组织中高表达，如膀胱癌、肺癌、肝癌、胃癌、淋巴瘤等[9-15]。本研究中癌组织中的阳性表达率明显高于相对应的癌旁组织(P<0.05)，由此推测Livin可能通过抑制乳腺细胞的正常凋亡而在乳腺癌的发生过程中发挥重要作用。

根据表1中可发现，Livin的表达与患者的病理类型、TNM分期及淋巴结转移明显相关(P<0.05)，而与年龄、肿瘤大小、胸壁侵犯、受体情况、5年生存期均无关(P>0.05)。分层分析显示：Livin的表达水平随着乳腺癌临床分期及淋巴结转移增加而增高；肿瘤体积越大、分期越晚、有淋巴结转移的患者Livin阳性表达例数增多，这与赵秋民[16]的报道一致。同时还分析发现，Livin在浸润性导管癌中的表达率明显高于非浸润性导管癌，这种与病理类型相关的Livin表达差异尚待进一步研究。

Smac是被Du等[17]从 HeLa细胞中分离出的一种蛋白，由线粒体膜间隙释放, 又称为第二个线粒体来源的胱天蛋白酶激活剂。它能促进细胞凋亡，与IAPS家族蛋白相互作用[18]。本研究中Smac在癌组织中的表达强度明显低于相对应的癌旁组织(P<0.05)；而且表达的阳性例数在癌组织中随表达强度增强而逐渐降低(表达强度+>++>+++)，在癌旁组织中却逐渐升高。目前，Smac相关制剂已用于实体瘤和血液系统肿瘤的Ⅰ期临床试验，以检测药物的安全性、药代动力学、最大耐受剂量及初步疗效[19]。另外，本研究中淋巴结转移者Smac蛋白表达下降，两者差异有统计学意义(P<0.05)，而与患者的年龄、肿瘤大小、病理学类型、胸壁侵犯、受体情况、5年生存期无关(P>0.05)，说明Smac表达降低或缺失可能与乳腺癌的发生发展有关。

抑凋亡蛋白Livin和促凋亡蛋白Smac之间有可能存在着某种关联。正常组织和细胞中，两者的动态平衡维持着正常的生理代谢，在肿瘤的发展中发挥协同效应。两者的相互调节过程涉及到多种因子的参与，深入研究二者在乳腺癌中的关系、作用及其机制，将为乳腺癌的治疗提供新思路。本研究使用Spearman相关性检验发现Livin和Smac蛋白在乳腺癌组织中的表达呈负相关(P<0.05)，即乳腺癌中livin蛋白表达上调，Smac蛋白表达下降，而且两者的表达均与乳腺癌的临床病理特征和生物学行为密切相关，推测两者共同参与肿瘤的调控，进而导致肿瘤快速增长。

本研究对43例乳腺癌患者进行了随访，经Kaplan-Meier生存曲线分析发现，Livin阴性表达组比阳性表达组术后5年无病生存率高，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示Livin的表达抑制细胞凋亡，导致细胞过度繁殖，患者可能预后不良，有可能成为评价乳腺癌预后的指标。而Smac阴性表达组与阳性表达组之间术后5年无病生存期差异无统计学意义(P>0.05)。因此，继续深入研究两者在乳腺癌中的关系及机制，或许具有重要的临床意义。

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