Akt抑制剂MK2206对膀胱癌细胞增殖凋亡的影响

颜丹萍，马频

(湖北省丹江口市第一医院药学部，丹江口 442700)

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(protein kinase B，PKB)，又名Akt蛋白[1]，是PI3K/Akt信号通路中的关键信号因子，能够调控细胞的增殖、活化和代谢等诸多生理活动[2]。研究发现，Akt在诸多肿瘤细胞中均有过表达的情况，且Akt的异常表达与癌细胞的异常增生、活化有密切关系[3]。MK2206作为Akt小分子变构抑制剂，能够抑制不同亚型的Akt因子，抑制肺癌细胞和卵巢癌细胞的增殖活化[4]。笔者在MK2206对其他恶性癌症研究的基础上，初步探讨其对膀胱癌T24细胞增殖、凋亡的影响，为临床上治疗膀胱癌提供参考。

1 材料与方法

1.1细胞株 膀胱癌细胞(T24)由武汉大学人民医院中心实验室馈赠。

1.2试剂与试药 MK2206(美国Selleck生物科技有限公司，货号：S1078)；MEM培养基(美国Gibco 公司，货号：SH30022.01B)；胎牛血清(四季青公司，货号：P30-3302)；胰蛋白酶-EDTA消化液(美国Gibco公司)；二甲亚砜(DMSO，美国Signal公司)；聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)配制试剂盒、GAPDH一抗等均购自武汉谷歌生物科技有限公司，Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin(均按照1：1000稀释)兔抗人一抗、羊抗兔二抗均购自美国Cell signaling technology 公司；流式细胞术凋亡试剂盒(PE-7AAD，美国BD公司)；CCK-8 试剂盒(日本同仁研究所)。

1.3仪器 超净工作台(苏州集团安泰空气技术有限公司)；CB150二氧化碳(CO2)细胞培养箱(德国Binder公司)；Victor 31420 Multilable Counter酶标仪(美国Perkin Elme 公司)；Heraeus Fresco 21低温微量离心机(德国Themo 公司)；FACS AriaⅢ流式细胞仪(美国BD公司)；Odyssey 双色红外激光成像系统(美国 LI-COR 公司)。

1.4细胞培养 在温度37 ℃、5%CO2培养箱中，于含10%胎牛血清，1%双抗(100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1链霉素)的MEM培养液中培养T24细胞。待细胞长至90%时，胰酶消化，重悬细胞。按每2.5×105个细胞接种于6孔板，待生长对数期，弃去旧培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，给予含不同浓度MK2206的1%血清培养基，培养24 h后提取总蛋白。

1.5CCK-8法检测不同浓度MK2206对T24细胞增殖的影响 收集T24细胞制备单细胞悬液，按照每孔1.5×104个细胞接种至96孔板中。待细胞达生长对数期，弃去旧培养基，PBS洗涤1次，加入含不同浓度的MK2206的1%血清培养液(终浓度分别为0，1，5，10，20 μmol·L-1)[5]，每组设6个复孔。37 ℃、5%CO2培养箱中分别培养24，48，72 h后，每孔加10 μL CCK-8，37 ℃培养箱中孵育30～60 min，酶标仪在450 nm处测定各孔吸光度(A)值。细胞存活率(%)=(实验组A值/对照组A值)×100%。

1.6Western blotting法测定MK2206对细胞内蛋白表达的影响 MK2206作用24 h后将各组培养皿置于冰上，加入PIPA裂解液收集细胞，于4 ℃下12 000×g离心25 min，取上清液，BCA法测蛋白浓度，其余的加入loading buffer在100 ℃变性5～10 min，-20 ℃保存备用。

按SDS- PAGE凝胶配制试剂盒配制10%分离胶和5%浓缩胶，取每组蛋白50 μg上样，电泳1.5 h，将蛋白转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上电转1.5 h。5%BSA封闭2 h，TBST洗涤，兔抗人一抗(Akt、p-Akt、GSK-3β、β-catenin、GAPDH)稀释液中4 ℃孵育过夜。洗涤，PVDF膜至羊抗兔二抗中，室温摇床上孵育1.5 h，洗涤，利用Odyssey成像系统扫膜分析，检测各组细胞内目的蛋白与内参条带的灰度值，计算二者比值。

2 结果

2.1CCK-8法检测不同浓度MK2206对T24存活率的影响 CCK-8实验结果表明，MK2206能够显著抑制T24细胞的增殖活力，且呈浓度-时间依赖性，见图1。该抑制剂处理时间在24，48，72 h时的半数抑制浓度(IC50)值分别为14.11，3.21，0.76 μmol·L-1。且相同处理时间下，在0～20 μmol·L-1浓度范围内，随着MK2206浓度的增加，抑制效果明显增加(P<0.05)，而当达到最大浓度20 μmol·L-1时，处理时间不是抑制T24细胞增殖的主要因素。

与对照组(未给药组)比较，*1P<0.05，*2P<0.01

图1 MK2206对T24细胞的增殖影响

Compared with control group (without drug treatment)，*1P<0.05，*2P<0.01

Fig.1EffectofMK2206ontheproliferationofT24cells

2.2MK2206对T24细胞凋亡的影响 不同浓度(0，1，5，10 μmol·L-1)MK2206作用T24细胞24 h后，流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果见图2，可见不同浓度的MK2206的细胞总凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)与对照组(未给药组)的(3.94±1.00)%比较，差异有统计学意义(P<0.01)。由图2可知，随着给药浓度的增加，晚期凋亡细胞显著增加(P<0.01)，其晚期凋亡率分别为(1.89±0.46)%，(4.77±0.84)%，(5.33±0.93)%和(30.97±1.32)%。

2.3MK2206对Akt因子的抑制作用 Western blotting法结果显示，采用0～10 μmol·L-1的MK2206处理T24细胞24 h后，Akt因子所在的信号通路被抑制，Akt总蛋白表达无明显差异，而给药组的p-Akt(ser347)蛋白的表达与对照组比较，显著降低(P<0.01)，见图3。

2.4MK2206对T24细胞GSK-3β/β-catenin信号通路的影响 Western blotting法检测不同浓度MK2206作用T24细胞24 h后，GSK-3β/β-catenin信号通路蛋白表达情况。结果见图4。与对照组比较，GSK-3β总蛋白的表达无明显差异(P>0.05)，而p-GSK-3β的表达显著降低(P<0.05)。当MK2206浓度为1 μmol·L-1时，β-catenin的表达量(0.53±0.04)，与对照组(0.56±0.06)比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而当浓度为5～10 μmol·L-1时，其表达量显著低于对照组(P<0.01)。结果见图4。

3 讨论

膀胱癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，多数为尿路上皮癌[6]。近年来对膀胱癌发病机制的研究不断增多和深入。PI3K/Akt信号通路是目前研究较多的一条重要的细胞凋亡通路，该通路对肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡等进程具有重要的调控作用[7]。Akt因子是一种具有高度灵活的胞质蛋白[8]，在生长因子的刺激下，PI3K能够使PIP2发生磷酸化并转化为PIP3，而PIP3可以与Akt发生结合，进而募集Akt由胞质向胞膜转移，从而使Thr308和Ser347位蛋白发生磷酸化，形成活化的Akt因子[9-10]，而活化的Akt因子又进一步促进糖原合成黑蛋白-GSK-3β发生磷酸化[11]，形成活化的GSK-3β并与之前结合的β-catenin发生解离，β-catenin呈游离状态在胞质内不断聚集凝结增多，部分由胞质转移入核从而调控下游基因的转录翻译过程，诱导一些炎症反应的发生[12]。

MK2206是Akt因子的一种口服变构蛋白激酶抑制剂，其可以抑制Akt因子的3种亚型，即Akt1、Akt2和Akt3[13]。临床研究发现在晚期实体肿瘤患者采用MK2206单一药物治疗过程中，患者具有较好的药物耐受性[14]，细胞药理实验表明，MK2206对肺癌NCI-H460细胞和卵巢癌A2780系细胞具有不同程度的抑制增殖、促进凋亡的作用[15]。MATSUZAKI等[16]研究发现MK2206联合氯奎宁对子宫内膜移位细胞的增殖和再生有抑制作用，且抑制效果优于单独用药。MK2206可以诱导细胞自噬，从而引起细胞凋亡[17]。WU等[18]研究发现，膀胱癌细胞的转移和侵袭能力受PI3K/Akt信号调控的GSK-3β/β-catenin的活性的影响。本实验研究表明，MK2206在浓度为1 μmol·L-1以上时，可有效抑制T24细胞Akt(Ser473)磷酸化，这为探索MK2206对T24细胞的Akt下游通路GSK-3β/β-catenin的影响奠定了基础。

A.对照组(未给药组)细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率；B.当MK2206给药浓度为1 μmol·L-1时，24 h时的早期凋亡率和晚期凋亡率；C.当给药浓度为5 μmol·L-1时，T24细胞24 h后的早期凋亡率和晚期凋亡率；D.当给药浓度为10 μmol·L-1时，24 h后T24细胞的早期凋亡率(右上)和晚期凋亡率(右下)。

图2 MK2206对T24细胞凋亡影响

A.early apoptosis and late apoptosis for control group (without drug treatment);B.early apoptosis and late apoptosis of T24 cells treated by 1 μmol·L-1MK2206 for 24 h;C.early apoptosis and late apoptosis of T24 cells treated by 5 μmol·L-1MK2206 for 24 h;D.early apoptosis and late apoptosis of T24 cells treated by 10 μmol·L-1MK2206 for 24 h.Up right is early apoptosis and low right is late apoptosis

Fig.2EffectofMK2206ontheapoptosisofT24cells

A.Western blotting法检测不同浓度MK2206对Akt/p-Akt蛋白表达影响条带图，GAPDH为内参蛋白；B.Akt/p-Akt蛋白表达水平的数据柱形图。与对照组(未给药组)比较，*1P<0.01

图3 MK2206对T24细胞Akt/p-Akt蛋白表达影响

A.Effect of MK2206 at different concentration on Akt/p-Akt protein expression detected by Western blotting using GAPDH as internal reference；B.The data bar chart for the expression level of Akt/ p-Akt protein.Compared with control group (without drug treatment),*1P<0.01

Fig.3EffectofMK2206ontheproteinexpressionofAkt/p-AktinT24cells

本研究采用Western blotting法检测了不同浓度MK2206 对T24细胞因子Akt下游通路蛋白GSK-3β/β-catenin的表达水平是否产生影响，结果表明MK2206通过抑制Akt因子磷酸化，进而降低GSK-3β的磷酸化和β-catenin蛋白表达水平，抑制了膀胱癌细胞增殖，促进凋亡。本研究为膀胱癌的药物治疗提供了一定的药理研究基础。

A.Western blotting法检测不同浓度MK2206对GSK-3β/β-catenin蛋白表达影响条带图，GAPDH为内参蛋白；B.GSK-3β/β-catenin蛋白表达水平的数据柱形图。与对照组(未给药组)比较，*1P<0.05，*2P<0.01

图4 MK2206对T24细胞GSK-3β/β-catenin信号通路的影响

A.Effect of MK2206 at different concentration on GSK-3β/β-catenin protein expression detected by Western blotting GAPDH as internal reference；B.The data bar chart for the expression level of GSK-3β/β-catenin protein expression detected protein.Compared with control group (without drug treatment),*1P<0.05，*2P<0.01

Fig.4EffectofMK2206onGSK-3β/β-cateninsignalpathwayinT24cells