胃康3号对功能性消化不良小鼠胃窦、十二指肠及脑组织NT、CGRP受体表达的影响

肖政华，谭芊任，崔峻松

(1 贵阳中医学院第二临床医学院，贵阳550002；2 贵阳中医学院第二附属医院)

基金项目：贵州省科学技术基金项目(黔科合J字[2012]2068号)。

功能性消化不良(FD)是指由多种因素引起的具有慢性消化不良症状，但不能用器质性、系统性或代谢性疾病等来解释的消化系统疾病[1]。FD的病因和发病机制还不十分清楚，以往多考虑与胃肠动力障碍、内脏高敏感性、社会心理等因素有关[2,3]。目前一致认为，脑肠轴异常是FD发病的根源。脑肠肽，如神经降压素(NT)、降钙素基因相关肽(CGRP)等，是脑肠轴双向交通通路的分子基础。脑肠轴异常时，脑肠肽分泌失调，继而导致胃肠运动功能紊乱和内脏敏感性增高。目前，西医治疗FD并无标准方案，主要采取抑制胃酸分泌、促进胃肠动力、根除幽门螺杆菌等对症治疗，虽然起效快、作用明显，但长期或大量使用上述药物，不良反应较多，且停药后易复发[4]。FD属中医“胃脘痛”“痞满”等范畴，常见证型为肝郁脾虚型。中医治疗FD起效虽然不如西医迅捷，但疗效稳定，不良反应少，复发率较低[5～8]。胃康3号是贵州省已故名老中医陈慈煦教授行医五十余载创立的临床经验方，也是贵阳中医学院第二附属医院治疗肝郁脾虚型“痞满”“胃脘痛”的协定方，已用于临床治疗肝郁脾虚型FD多年，但对其作用机制尚不明确。本研究观察了胃康3号对FD小鼠胃窦、十二指肠和脑组织NT、CGRP受体表达的影响，旨在从脑肠轴角度探讨胃康3号治疗FD的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级、昆明种小鼠40只，雌雄各半，1月龄，体质量18～22 g，购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司，动物许可证号：SCXK-(军)2012-0011。所有小鼠分笼饲养，每笼10只。动物房温度18～22 ℃，湿度50%～60%，光照12 h明暗交替。实验期间自由摄食、饮水。胃康3号，由四川新绿色药业科技发展股份有限公司生产的智能颗粒组成，方药组成：柴胡12 g、党参12 g、白芍12 g、佛手9 g、延胡索6 g、川楝子9 g、丹参10 g、炒白术15 g、茯苓12 g、木香6 g、陈皮6 g、甘草4 g。由贵阳中医学院第二附属医院智能中药房将所有颗粒混合，加水，用恒温水浴锅浓缩至含生药0.675 g/mL。多潘立酮，购自西安杨森制药有限公司，规格10 mg/片，实验前用蒸馏水配制成0.5 mg/mL药液。RM2016型轮转切片机，上海徕卡仪器有限公司；XSP-C204双目生物显微镜，重庆重光实业有限公司；Image Pro Plus6.0图像分析系统；电热恒温水浴箱，上海医疗器械七厂。兔抗小鼠CGRP单抗、兔抗小鼠NT单抗，北京博奥森生物技术有限公司；SP-9000免疫组化染色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 动物分组处理 所有小鼠适应性喂养3 d，随机抽取10只作为对照组，剩余小鼠参照文献[9]并加以改进，制备不可预知的慢性应激模型。应激程序：①食物剥夺24 h；②明暗颠倒24 h；③饮水剥夺合并空瓶刺激12 h；④湿笼饲养24 h；⑤强迫游泳5 min(水温45 ℃)；⑥倒悬30 min；⑦束缚30 min；⑧超声波噪音2 h；⑨夹尾1 h。每天随机选取任意一种应激项目，相邻两天选择的项目不能相同，连续21 d。每天08：30更换应激项目，每种项目使用2～3次。当小鼠逐渐出现烦躁易怒、饮食下降、毛发枯槁、体质量减轻，小肠推进率下降，胃残留率增加，同时出现血清GAS、MTL水平降低[10]，即FD模型制备成功。30只小鼠均制成FD模型，无死亡。随机将FD模型小鼠分为模型组、多潘立酮组、胃康3号组，每组10只。制模第22天，参照文献[11]，多潘立酮组给予0.5 mg/mL多潘立酮药液7.56 mL/(kg·d)灌胃，胃康3号组给予含生药0.675 g/mL胃康3号药液7.56 mL/(kg·d)灌胃，模型组给予等量蒸馏水灌胃，连续灌胃7 d。对照组正常喂养，不建模。

1.3 胃窦、十二指肠及脑组织NT、CGRP受体表达检测 采用免疫组化SP法。模型组、多潘立酮组、胃康3号组末次灌胃次日，对照组同日，用10%水合氯醛4.0 mL/kg麻醉，无菌条件下取出胃窦、十二指肠和脑组织。各组织用4%多聚甲醛固定1 h，依次放入15%、20%、30%蔗糖溶液沉底24 h。OTC包埋，18 μm厚连续切片。3% H2O2去离子水孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶活性；PBS冲洗3 min×3次，加入正常山羊血清100 μL，室温孵育15 min；弃血清，分别加入兔抗小鼠NT或CGRP单抗(稀释比均为1∶500)，37 ℃孵育2 h；PBS冲洗3 min×3次，加入SP-9000生物素化二抗100 μL，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗3 min×3次，加入辣根酶标记的链霉卵白素100 μL，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗3 min×3次，DAB染色10 min，双蒸水终止染色，苏木素复染1 min，贴片，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，水溶性封片剂封片，显微镜下观察。用正常山羊血清和0.01 mmol/L PBS(pH 7.3)代替一抗作空白对照，以检查免疫反应的特异性。结果判定标准：在胃窦、十二指肠组织中，NT、CGRP阳性染色定位于细胞膜和细胞质，呈棕色或棕黄色；在脑组织中，NT、CGRP阳性染色定位于神经元的细胞膜，呈棕色或棕黄色深染。每张切片随机选取5个400倍不重叠视野，采用Image Pro Plus6.0图像分析系统分析光密度值(胃窦、十二指肠组织)或阳性细胞数(脑组织)。以其光密度值或阳性细胞数作为NT、CGRP受体相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 各组胃窦组织NT、CGRP受体表达比较见表1。

表1 各组胃窦组织NT、CGRP受体相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01。

2.2 各组十二指肠组织NT、CGRP受体表达比较见表2。

表2 各组十二指肠组织NT、CGRP受体相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01。

2.3 各组脑组织NT、CGRP受体表达比较见表3。

表3 各组脑组织NT、CGRP受体相对表达量比较(个

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01。

3 讨论

FD的病因和发病机制尚不完全清楚，以往多考虑与胃肠动力障碍、内脏高敏感性、社会心理因素等有关，目前认为脑肠轴异常是其发病的根源。胃肠动力障碍和内脏高敏感性是FD的重要病理生理学机制[1]，脑肠轴异常可导致胃肠道动力和感觉异常，对各种应激的运动反应增强和内脏的高敏感性。脑肠肽又称胃肠激素，是一种小分子肽类活性物质，在胃肠和中枢神经系统双重分布，主要分布在脊髓、延髓、下丘脑及胃肠道系统。脑肠肽是脑肠轴双向交通通路的分子基础，是连接和调控脑肠轴交互作用的枢纽，直接参与调节胃肠道的运动、感觉和分泌，并参与情绪的调控，具有神经递质和激素双重作用，是联系认知感情中枢和神经内分泌、肠神经系统与免疫系统之间的双向交通通路[12]。至今已发现脑肠肽60余种。

NT是一种重要的脑肠肽，广泛分布于哺乳动物的脑和胃肠道中。生理浓度NT可抑制胃酸分泌，减少胃蠕动，延缓胃排空，对胃肠运动主要起抑制作用[13，14]。Bardella等[15]研究发现，消化不良者外周血NT水平明显升高，从而产生腹痛、腹泻等肠道激惹症状。CGRP亦是一种重要的脑肠肽，广泛分布于中枢和外周神经系统，特别是感觉神经元胞体和末梢以及胃肠道壁内神经丛。CGRP在消化系统的生理病理机制中具有重要作用，可抑制胃酸分泌、减少胃肠蠕动、增加胃黏膜血流、调节其他胃肠激素分泌以及保护胃黏膜等作用。另外，无论是中枢还是外周CGRP的释放均参与内脏敏感性变化[16]，而内脏高敏感性一直被认为是功能性胃肠道疾病的主要发病机制之一[17]。

FD属中医“胃脘痛”“痞满”等范畴，常见证型为肝郁脾虚型。其病位在脾胃，但与肝脾密切相关。《素问·宝命全形论》就有“土得木而达”，强调了肝木对脾土的促进、疏通畅达作用。此外，“培土”可以“荣木”，只有脾胃功能正常，气血生化有源，肝才有气血濡养，肝血才有所藏。因此，中医肝脾在生理上相互为用，在病理上互相影响。临床常见因情志抑郁恼怒，肝失疏泄，气机郁滞，导致脾失健运而出现肝脾不调，表现为纳呆痞满、腹胀腹痛、胸闷太息等。因此，中医治疗FD应以疏肝健脾、行气和胃为原则。

胃康3号是贵州省已故名老中医陈慈煦教授行医五十余载创立的临床经验方，也是贵阳中医学院第二附属医院治疗肝郁脾虚型“痞满”“胃脘痛”的协定方，已在临床应用多年，对肝郁脾虚型FD疗效较好。方中柴胡疏肝解郁，党参健脾益气，共为君药；陈皮理气开胃，木香、佛手、川楝行气止痛、导滞和中，白术培补中焦，共为臣药；白芍养血柔肝，丹参行血散瘀，延胡索活血散瘀，利气止痛，茯苓渗湿健脾，兼防参术生热，共为佐药，甘草为使药。诸药合用，共奏疏肝理气、健脾益胃、行气止痛之功。但其对脑肠轴的影响尚不清楚。

本研究结果显示，模型组胃窦、十二指肠、脑组织NT、CGRP受体相对表达量均明显高于对照组，而多潘立酮组、胃康3号组胃窦、十二指肠、脑组织NT、CGRP受体相对表达量较模型组均明显下调，且多潘立酮组与胃康3号组不同组织NT、CGRP受体相对表达量比较差异无统计学意义。结果表明，FD小鼠胃窦、十二指肠、脑组织NT、CGRP受体表达明显升高，经多潘立酮或胃康3号治疗，在胃肠功能恢复同时，NT、CGRP受体表达均明显下调，且胃康3号与多潘立酮的效果相当。

综上所述，胃康3号能下调FD小鼠胃窦、十二指肠、脑组织NT、CGRP受体表达，这可能是其治疗FD的作用机制之一。今后我们将继续深入研究，以明确胃康3号对其他脑肠肽有无影响，以进一步明确其对脑肠轴的影响。