原发性肝癌组织TACC3、p53蛋白表达变化及其与患者临床病理特征和预后的关系

马洪斌，刘建勇，卢诚震

(1 天津市宁河区医院，天津301500；2 天津市第二人民医院)

原发性肝癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤之一，近年来其发病率有明显上升趋势[1，2]。原发性肝癌起病比较隐匿，早期一般无明显症状，当出现明显肝区疼痛、黄疸、腹水等症状时，病情已属中晚期，患者预后较差。尽管近年来以外科手术为主的综合治疗取得了很大进展，但原发性肝癌术后复发率和转移率仍然较高[3]。因此，进一步探索原发性肝癌发病的分子机制，有可能为其诊断和治疗提供新的思路。转录相关酸性卷曲蛋白3(TACC3)基因定位于染色体4p16.3，含有高度保守的C-末端卷曲螺旋结构域，其主要功能是在细胞有丝分裂时保持中心体微管成核稳定和中心体完整性[4]。有研究发现，原发性肝癌细胞TACC3表达升高，而敲除TACC3则可抑制肿瘤细胞增殖[5]。p53蛋白是一种相对分子质量为43.7 kD的蛋白质，主要分布于细胞核，可参与细胞周期调控、细胞凋亡、DNA损伤修复等生物学过程。有研究发现，TACC3基因通过与p53基因相互作用，继而调节p53基因功能。在正常细胞中，TACC3基因表达变化可能会影响细胞纺锤体功能，这时依赖p53基因的检查点会发现细胞未进行有丝分裂，从而诱导细胞凋亡。如果p53基因发生突变，则不能诱导细胞凋亡，继而导致肿瘤形成[6]。本研究观察了原发性肝癌组织TACC3、p53蛋白表达变化，并分析其表达变化与患者临床病理特征和预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年6月～2015年6月天津市宁河区医院收治的初诊原发性肝癌患者112例。所有患者经组织病理检查明确诊断[7]，且入院前未行任何抗肿瘤治疗。排除合并重要脏器严重疾病者、不能配合治疗或随访者。其中，男78例、女34例，年龄39～72(55．2±14.8)岁；肿瘤数目：单发92例，多发20例；肿瘤最大直径：<5 cm 81例，≥5 cm 31例；临床分期[8]：Ⅰ期30例，Ⅱ期47例，Ⅲ期例21例，Ⅳ期14例；组织分化程度：高中分化78例，低未分化34例；有淋巴结转移69例，无淋巴结转移43例。本研究经天津市宁河区医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 TACC3、p53蛋白表达检测 采用Western blotting法。取肝癌组织与癌旁组织(距肿瘤组织边缘>2 cm)各112例份，RIPA裂解液充分裂解，提取组织总蛋白，经BCA法蛋白定量合格。加入5×蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴10 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白50 μg，行SDS-PAGE(5%浓缩胶，15%分离胶)，浓缩胶电压90 V，分离胶电压120 V。当溴酚蓝跑胶至电泳槽下端时停止电泳，电泳时间约3 h。电泳结束，采用湿转法将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上(恒流200 mA转膜2 h)。50 g/L脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，分别加入兔抗人TACC3一抗(稀释比1∶500)、兔抗人p53单克隆抗体(稀释比1∶500)、β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。次日，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(稀释比1∶5 000)，室温孵育2 h。ECL发光，暗室中曝光、显影。采用凝胶成像分析系统扫描，Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 随访 所有患者出院后定期采用电话或门诊方式随访，随访截至2018年6月。以患者死亡或至随访截至日期结束随访，统计3年生存率。

2 结果

2.1 肝癌组织与癌旁组织TACC3、p53蛋白表达比较 肝癌组织与癌旁组织TACC3相对表达量分别为0.79±0.21、0.37±0.13，p53蛋白相对表达量分别为0.80±0.11、0.41±0.14。肝癌组织TACC3、p53蛋白相对表达量均明显高于癌旁组织(t分别为2.431、3.422，P均<0.05)。

2．2 肝癌组织TACC3表达与p53蛋白表达的关系 Pearson相关分析显示，肝癌组织TACC3表达与p53蛋白表达呈正相关关系(r=0.613，P<0.05)。

2.3 肝癌组织TACC3、p53蛋白表达与患者临床病理特征的关系 肝癌组织TACC3、p53蛋白表达与肿瘤最大直径、临床分期、组织分化程度、淋巴结转移有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤数目无关(P均>0.05)。见表1。

2.4 不同TACC3、p53蛋白表达者预后比较 所有患者随访2～36个月，中位随访时间27个月。随访期间死亡75例，无失访。以TACC3、p53蛋白表达的平均值为临界值，将患者分为TACC3或p53蛋白高表达者与低表达者。其中，TACC3高表达者与低表达者分别为58、54例，其3年生存率分别为27.5%(16/58)、38.8%(21/54)；p53蛋白高表达者与低表达者分别为60、52例，其3年生存率分别为23.3%(14/60)、44.2%(23/52)。TACC3、p53蛋白高表达者3年生存率均明显低于其低表达者(χ2分别为4.843、4.020，P均<0.05)。见图1、2。

表1 肝癌组织TACC3、p53蛋白表达与患者临床病理特征的关系

图1 不同TACC3表达者生存曲线

图2 不同p53表达者生存曲线

3 讨论

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其病因和发病机制尚不完全清楚。目前，临床上常用的肿瘤标志物，如甲胎蛋白、热休克蛋白、癌胚抗原等，对原发性肝癌的早期诊断、病情评估和预后判断等价值有限[9]。因此，进一步探索原发性肝癌发病的分子机制，寻找一种敏感性和特异性均较高的肿瘤标志物具有重要意义。

有丝分裂是真核生物细胞分裂的主要方式，具有周期性。细胞周期发生异常，易引起染色体不稳定、基因突变等。中心体由一对中心粒组成，是微管的组织中心，可参与有丝分裂和分裂间期过程中微管的调节。转录相关酸性卷曲蛋白(TACC)是有丝分裂纺锤体的重要组成部分，其C端存在高度保守的TACC结构域，使其聚集在中心体卷曲螺旋中。TACC3是TACC家族成员之一。近年研究发现，在结直肠癌、前列腺癌等组织中TACC3高表达，且其高表达与肿瘤进展和患者不良预后有关[10，11]。在有丝分裂期间，TACC3定位于中心体，并可与chTOG蛋白、网格蛋白一起形成一种复合物，稳定中心体微管并保持中心体完整性。TACC3过表达可通过影响细胞周期调节因子，促进肿瘤细胞绕过细胞周期通路的检查点；而通过shRNA干扰TACC3表达，可使肿瘤细胞处于G1期阻滞状态[12]。本研究结果发现，原发性肝癌组织TACC3相对表达量明显高于癌旁组织，与贺伟等[13]报道一致。本研究还发现，原发性肝癌组织TACC3表达与肿瘤最大直径、临床分期、组织分化程度、淋巴结转移有关，而与患者性别、年龄和肿瘤数目无关。说明TACC3可能参与原发性肝癌的发生、发展。进一步研究发现，TACC3高表达者3年生存率明显低于TACC3低表达者。Ha等[14]研究表明，原发性肝癌细胞TACC3高表达时，上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达增加，如S100A4、ezrin、uPAR等，继而激活磷脂酰肌醇3-激酶和细胞外信号调节蛋白激酶信号通路，从而促进肿瘤细胞发生EMT。因此，TACC3高表达者预后不良可能与TACC3促进EMT，继而导致肿瘤进展有关。

p53基因是细胞内一个重要的细胞周期检查点。当各种因素导致基因组DNA损伤后，p53基因可上调p21基因表达，抑制细胞周期蛋白依赖性激酶2，使细胞周期阻滞于G1期。p53基因突变后，使p53蛋白空间构象改变，继而影响p53蛋白磷酸化及生物学功能，导致突变型p53蛋白在细胞内大量堆积。突变型与野生型p53蛋白结合，进一步抑制p53基因功能，导致细胞异常增殖。p53基因对中心体活性和细胞周期调控具有重要意义。有研究表明，p53基因可诱导中心体缺陷使细胞周期G1期阻滞[15]，细胞分裂失败，继而逃避检查点检查，最终引起多效性缺陷。由于不均等分离，中心体扩增和非整倍性导致肿瘤进一步恶化。有研究发现，约75%胰腺癌患者存在p53基因突变，从而导致中心体扩增和染色体结构不稳定，继而促进肿瘤侵袭和转移[16]。本研究结果发现，原发性肝癌组织p53蛋白相对表达量明显高于癌旁组织；原发性肝癌组织p53蛋白表达与肿瘤最大直径、临床分期、组织分化程度、淋巴结转移有关，而与患者性别、年龄、肿瘤数目无关；p53蛋白高表达者3年生存率明显低于p53蛋白低表达者。上述结果与郭晓东等[17]报道一致。说明p53蛋白亦可参与原发性肝癌的发生、发展。本研究还发现，TACC3与p53蛋白表达呈正相关关系。表明TACC3可能通过影响p53蛋白表达，参与细胞周期调控。TACC3是EMT的启动子，能被内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞等膜上的受体激活，从而促进肿瘤进展；Wnt信号通路异常，可引起TACC3过表达，胞质内游离的β-catenin进入胞核，激活下游癌基因，如p53、Ras等[18，19]。因此，抑制肿瘤细胞TACC3表达，p53信号通路亦受到抑制，从而逆转肿瘤细胞G1期阻滞。

综上所述，原发性肝癌组织TACC3、p53蛋白表达明显升高，其表达变化与肿瘤进展和患者预后不良有关。TACC3、p53蛋白有可能成为诊断原发性肝癌的生物学标志物和治疗靶点。