头穴丛刺联合多奈哌齐对阿尔茨海默病大鼠海马及皮层区ChAT及AchE活性的影响

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)作为老年期痴呆最常见的痴呆类型,其发病过程极为隐匿,记忆力减退是首发症状且进行性加重。截至2015年,我国痴呆人数居世界之最,高达950万,同时预计到2050年痴呆人数将突破1.31亿[1-2]。在AD前期发展过程中,胆碱能神经元损伤在认知功能下降中扮演着不可或缺的角色,与Aβ沉积并存[3]。本研究通过Aβ诱导老年痴呆模型,头穴丛刺观察治疗前后AD大鼠海马及皮层区乙酰胆碱转移酶(ChAT)、乙酰胆碱酯酶(AchE)活性变化,从而进一步探讨其作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 体质量为250～300 g的60只Wistar大鼠均由黑龙江中医药大学实验动物中心提供,普通环境喂养,随机分为4组:假手术组、模型组、治疗组、对照组,每组15只。

1.2 试验药物、试剂和仪器 多奈哌齐(安理申)由PFIZER PGM公司生产制造,产品批号:5136903,5 mg/片;Aβ1-42由美国Sigma公司生产;Moirrs水迷宫系统(成都泰盟科技有限公司);DW-5立体定位仪(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备:10%水合氯醛大鼠腹腔注射麻醉,固定于大鼠脑立体定位仪上,常规颅顶部剃毛消毒,暴露头部皮肤沿头部中线剪开,仔细将骨膜剔除充分暴露头骨,选择双侧海马CA1区为注射靶区(前囟点向后3.6 mm,旁开2.7 mm),钻孔后将10 mL Aβ1-42寡聚体注入其中,每侧5 mL,拔针后清创缝合消毒防止感染[4]。

1.3.2 干预方法:假手术组:假手术组每侧海马区注射5 mL蒸馏水。模型组:造模后同等抓握和喂养。对照组:造模后3 d,参照“人和动物间按体表面积折算的等剂量比值表”给予安理申0.45 mg/(kg·d)灌胃治疗。治疗组:造模3 d后,在安理申灌胃基础上根据于致顺教授头部七区划分法,参考《大鼠穴位图谱》所示,定位大鼠神庭穴、百会穴及其左右各旁开2 mm处,选用0.25 mm×25 mm针灸针进行针刺,针刺方向从后往前(百会透神庭),快速捻转1 min,1次/d,每次2 h,干预周期为4周,每周日休息1 d。

1.4 观察指标

1.4.1 Morris水迷宫检测:于针灸治疗结束后次日开始,历时5 d[5]。

1.4.2 HE染色:观察海马及皮层区组织病理形态学变化。

1.4.3 海马及皮层区ChAT、AchE活性的变化:采用比色法观察,具体操作步骤严格按照说明书进行。

2 结果

2.1 水迷宫实验结果 模型组与假手术组相比,大鼠的逃避潜伏期被延长,第二象限百分比和跨越平台次数减少,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,对照组与治疗组都大大缩短了AD大鼠逃避潜伏期,增加了第二象限百分比及跨越平台的次数(P<0.05,P<0.01);且治疗组优于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组水迷宫实验结果比较

注：与假手术组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01;与对照组比较,△P<0.05

2.2 海马及皮层区组织病理形态学影响

2.2.1 海马区:假手术组大鼠海马区神经细胞布列趋势较紧密,神经元形态尚规则,无组织水肿,散见少量凋亡小体和炎性细胞,血管无充血。模型组大鼠海马区神经细胞布列趋势紊乱,神经元形态欠规则,胶质细胞数目显著增加,可见大量神经元凋亡小体和炎性细胞,毛细血管肿胀。治疗组、对照组大鼠海马区病理改变较模型组有明显改善。主要表现为各组大鼠海马区疏松程度明显减轻,神经元细胞核固缩数目、胶质和炎细胞数目明显减少,毛细血管肿胀减轻,神经细胞布列趋势相对紧密。见图1。

2.2.2 皮层区:假手术组细胞形态尚规则,结构相对正常。模型组神经元形态欠规则,数目减少,胶质细胞数目增多。治疗组、对照组大鼠皮层区病理改变较模型组有明显改善。主要表现在神经细胞布列较规则,数目显著增多,胶质细胞减少明显。见图2。

图1 各组大鼠海马区组织病理形态比较(HE染色,×400)

图2 各组大鼠皮层区组织病理形态比较(HE染色,×400)

2.3 头穴丛刺对AD大鼠海马及皮层ChAT活性的影响 与假手术组比较,模型组海马皮层区ChAT水平下降(P<0.01);对照组海马和皮层区ChAT水平与模型组差异无统计学意义(P>0.05),治疗组海马皮层区ChAT水平与模型组、对照组相比均升高(均P<0.01)。

假手术组海马和皮层区ChAT水平比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组、对照组海马和皮层区ChAT水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05),海马区水平低于皮层区;治疗组海马和皮层区ChAT水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.4 头穴丛刺对AD大鼠海马及皮层AchE活性的影响 与假手术组相比,模型组海马皮层区AchE水平显著上升(P<0.01);与模型组相比,治疗组、对照组海马和皮层区AchE水平均下降(P<0.01或P<0.05);与对照组相比,治疗组海马皮层区AchE水平下降(P<0.01或P<0.05)。

图3 各组ChaT水平比较

假手术组海马和皮层区AchE比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组、对照组海马和皮层区AchE水平比较差异有统计学意义(均P<0.05),海马区水平高于皮层区;治疗组海马和皮层区。AchE水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图4 各组AchE活性比较

3 讨论

Aβ假说是AD主流假说之一,该假说认为超出常量的具有神经毒性的Aβ在痴呆病人脑内异常堆积,引起老年斑、神经纤维缠结和炎症反应,最终造成神经凋亡[6]。Aβ1-42诱导的AD大鼠模型是被公认的较为成功的老年痴呆模型,该模型不仅出现痴呆病人该有的记忆缺损下降,同时兼具痴呆病人脑内神经病理学特征,已被广泛接受[7-8]。实验中Aβ用于脑内注射的主要成分为Aβ1-40、Aβ25-35、Aβ1-42(毒性最强)。与Aβ1-40相比Aβ1-42疏水性更强,更利于淡粉样斑块沉积,相对于Aβ25-35,Aβ1-42神经纤维缠结更易于形成，且Aβ1-40、Aβ25-35诱导的AD的模型持续时间较短,因此Aβ1-42被运用于诱导老年痴呆模型更加贴近老年痴呆病人病理表现,模型更易于成功[9]。胆碱能神经元由于在脑内分布广泛,主要包括基底前脑胆碱能神经元、纹状体等,因此其支配着几乎所有的脑区[2]。而胆碱能损伤假说也是其发病的重要机制之一。乙酰胆碱(Ach)作为一种中枢胆碱能神经递质与AD的发生密切相关,Ach的含量与ChAT和AchE的活性相关:ChAT能够促进Ach的合成而AchE却能分解Ach,两者共同维持着Ach的动态平衡[10]。上调ChAT活性和下调AchE活性是协调机体内Ach平衡的唯一途径[11]。本研究发现Aβ1-42模型大鼠能迅速地出现脑内Aβ过度沉积,形成显著的学习记忆低下问题,海马及皮层区的ChAT的活性下降、AchE活性升高,其中海马区ChAT活性低于皮层区,AchE活性高于皮层区。对照组结果显示多奈哌齐能够明显地抑制AchE,而对ChAT效果甚微,海马区ChAT活性低于皮层区,AchE活性高于皮层区。治疗组结果显示头穴丛刺联合盐酸多奈哌齐疗效明显优于单纯对照组,不仅能够进一步上调ChAT活性,下降AchE活性,且ChAT、AchE活性在海马和皮层区差异无统计学意义。头穴丛刺是于志顺教授在总结前人经验的基础上提出的关于“针场”和“头部区域划分”的头针理论,在实验和临床工作中得到验证并发挥出显著的疗效,由原先单一的点刺或是线刺扩展到面刺,不仅扩大了针刺面积同时加强了刺激量[12],并且针刺时间也大大延长,长留针不仅缩短了治疗时间同时也减轻病人由于针刺造成的疼痛。本课题在前期研究中已经证实头穴丛刺能够调控胆碱能系统从而改善AD病人的学习记忆状况[13]。本次实验将多奈哌齐作为基础药物治疗配合头穴丛刺,发现联合治疗效果更加明确,且两者都是通过上调ChAT活性和下调AchE活性来改善AD病人的学习记忆能力。