PCOS大鼠血清中miR-200b及靶基因VEGF的表达及临床意义

张玲，史许锋，宋婉玉，张展

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是自青春期发病贯穿女性一生的常见内分泌性疾病，具有异质、复杂及进行性发展的特点[1]，其确切的发病机制仍不清楚。临床上常表现为月经异常、不孕、肥胖、痤疮，未长期管理可导致心血管疾病、代谢性疾病、子宫内膜癌变发生率明显增高。微小RNA（microRNA，miRNAs）借助对下游靶基因的调控从而影响卵泡发育，并在卵巢相关性疾病中发挥积极作用。有研究发现在PCOS患者的卵巢组织、卵泡液及颗粒细胞中均存在异常表达的miRNAs，提示miRNAs有望成为PCOS诊断的生物学标志物之一[2]。本研究通过检测PCOS大鼠血清中miR-200b及靶基因血管内皮生长因子（VEGF）的表达以期为PCOS诊治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及动物模型的制备取60只6周龄SD雌性大鼠（由郑州大学医学院实验动物中心提供），随机分为实验组、对照组和空白组，每组各20只。将1 mg/（kg·d）来曲唑溶于1%羧甲基纤维素（carboxmethyl cellulose，CMC）中灌胃实验组大鼠，仅用1%CMC灌胃对照组，均连续灌服21 d，空白组大鼠正常饮食。每日阴道涂片动态观察3组大鼠动情周期变化。

1.2 标本采集及处理3组大鼠禁食12 h后缺血法致死，心脏取血5 mL，迅速离心后收集血清，-40℃冻存备用；10%甲醛溶液固定大鼠子宫及双侧卵巢包被蜡块，待行HE染色和免疫组织化学染色。以上实验均经过河南省人民医院伦理委员会批准施行。

1.3 血清性激素水平测定采用放射免疫法测定大鼠血清黄体生成激素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）和睾酮（T）水平，试剂盒由天津九鼎医学生物工程有限公司提供，质量控制符合要求。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR）法采用real-time PCR法检测大鼠血清miR-200b和VEGF的表达。引物及探针，采用Prime6.0软件设计，用Gene Blast进行同源检索后，由上海生工生物工程股份有限公司合成，以β-actin作为内参照，严格按照real-time PCR试剂盒检测说明书操作，根据标准品的不同浓度梯度Ct值来设计标准曲线；各样本的拷贝数通过与其对应的内参β-actin比较后计算。

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0进行统计学分析，定量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCOS大鼠模型鉴定及对比应用来曲唑12 d后实验组大鼠失去规律的动情周期，取而代之均处于动情间期（大量白细胞，偶见少量角化上皮细胞），提示无排卵。而对照组及空白组大鼠镜下可见规律的动情周期。见图1和图2。

2.2 3组大鼠卵巢组织形态学变化实验组可见大量囊状扩张卵泡，颗粒细胞层减少至2～3层，各级卵泡和黄体少见甚至消失；对照组和空白组均见到各级发育的卵泡及黄体，颗粒细胞多为8～9层。见图3。

2.3 3组大鼠血清性激素水平变化与对照组、空白组相比，实验组大鼠血清LH、T水平显著升高（P＜0.01），血清 FSH、E2、P 水平显著下降（P＜0.01）。见表1。

2.4 3组大鼠血清中miR-200b及VEGF的表达与对照组、空白组相比，实验组大鼠血清miR-200b表达下降（P＜0.01），VEGF表达显著升高（P＜0.01）。见表2。

3 讨论

据统计全球不孕症女性中PCOS发病率为30%～40%，在排卵障碍性不孕者中为75%[3]。临床在进行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）助孕的患者中，PCOS患者存在卵母细胞成熟度不足、卵子质量差等问题，导致胚胎种植潜能明显低于其他不孕患者[4]。PCOS严重危及女性健康，对其发生机制的研究一直是妇科内分泌领域的焦点及热点。

图1 SD大鼠规律的动情周期阴道涂片（巴氏染色×400）

图2 实验组大鼠动情周期阴道涂片（巴氏染色×400）

图3 3组大鼠卵巢组织形态学变化（HE染色×100）

表1 3组大鼠血清性激素水平比较 （±s）

表1 3组大鼠血清性激素水平比较 （±s）

注：a与对照组比较，P＜0.01；b与空白组比较，P＜0.01。

组别nLH（IU/L）FSH（IU/L）E2（pmol/L）P（nmol/L）T（nmol/L）实验组 20 7.029±1.087ab 1.995±0.828ab 34.738±4.621ab 22.711±5.340ab 6.977±0.298ab对照组 20 4.905±0.733 2.503±0.705 45.468±6.179 70.938±8.080 2.769±0.127空白组 20 4.729±0.654 2.548±0.449 44.229±5.290 67.263±6.935 2.792±0.146 F 48.704 8.903 25.035 369.340 3 909.560 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表23 组miR-200b及VEGF mRNA水平比较 （±s）

表23 组miR-200b及VEGF mRNA水平比较 （±s）

注：a与对照组比较，P＜0.01；b与空白组比较，P＜0.01。

组别 n miR-200b VEGF实验组 20 0.913±0.362ab 87.680±32.831ab对照组 20 1.845±0.419 59.517±17.604空白组 20 1.736±0.633 61.421±16.302 F 37.490 11.804 P 0.000 0.000

3.1 来曲唑诱导PCOS大鼠模型的评价因PCOS患者临床取材较困难，目前有多种造模方法用于PCOS基础研究以指导临床治疗。本研究依据雄激素向雌激素转化的关键性限速酶是芳香化酶这一理论[5]，采用芳香化酶抑制剂——来曲唑方法诱导造模[6]。这种造模方法无论是从大体解剖组织学改变还是内分泌改变均是一种可靠的PCOS动物模型。本实验复制的动物模型无论是从大鼠动情周期紊乱、卵巢多囊样改变，还是大鼠血清性激素水平的变化均与人PCOS患者相似，说明我们的PCOS大鼠模型是制备成功的，也为后续研究打下了基础。

3.2 miR-200b与PCOS的关系目前国内外多集中在miR-200b与肿瘤（如胃癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌等）的增殖及复发转移等的研究[7]，而关于miR-200b在PCOS发病机制中作用的研究甚少。miR-200b可通过调节目的基因Fog2的表达诱导白细胞介素6（IL-6）糖原合成，参与脂代谢，促进2型糖尿病和胰岛素抵抗的发生。贾月月等[8]发现PCOS患者卵巢颗粒细胞中miR-200b异常表达并与胰岛素抵抗有直接相关性。

3.3 VEGF与PCOS的关系卵巢血管生成障碍可引起卵巢间质、卵泡血管增生，造成卵巢增大并诱发性激素分泌异常是导致PCOS病情发展的原因之一。VEGF是血管内皮生成因子，通过酪氨酸激酶途径参与卵巢血管内皮细胞的分裂，促进组织血管的形成，提高毛细血管的通透性，并引起组织血浆蛋白外渗。多项临床研究发现，VEGF通过卵泡内的氧化过程，影响卵泡的优化及胚胎着床[9]。在PCOS患者卵巢内VEGF的异常表达，引起卵巢间质血管增生、扩张并出现丰富的血流信号[10]，是最终导致PCOS患者无优势卵泡发育的重要原因之一。

3.4 miR-200b、VEGF与PCOS的关系有研究利用荧光素酶活性检测法验证了VEGF是miR-200b的下游靶基因，miR-200b可通过直接靶向VEGF，抑制视网膜母细胞瘤细胞生长与侵袭[11]。然而VEGF是否是通过miR-200b的调控在PCOS发病机制中发挥作用，目前国内外尚未见报道。本研究发现PCOS大鼠血清中miR-200b表达下调及靶基因VEGF表达上调，分析其原因考虑是由于PCOS血清中miR-200b表达降低，从而解除了对靶基因VEGF的抑制作用，通过转录水平导致更多VEGF基因的产生，影响卵泡正常发育及成熟，最终导致排卵障碍。

综上所述，PCOS大鼠模型血清中miR-200b与靶基因VEGF异常表达参与PCOS的发生、发展，推测miR-200b可作为PCOS疾病的一种新型非侵入性的诊断标志物。然而miRNAs上游及下游调控通路如何在卵泡发育、排卵等方面发挥作用并不完善，仍需进一步深入研究，以揭示miRNAs在PCOS中的作用机制，为今后PCOS的诊断和治疗提供新的依据和治疗靶点。