QF-PCR对孕妇SMN1基因筛查并应用于产前诊断

任晨春，郭东花，梁玥宏，王文靖，田秀英，崔洪艳，陈成彬，王玲红，杨微微，张海霞，李晓旭

脊肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）作为最常见的一种常染色体隐性遗传的致死性神经、肌肉疾病，以发展性、成对称性的肌肉无力和萎缩作为主要的临床特点，近侧端肌肉受累严重于远端肌肉，下肢肌肉累及较上肢严重[1-3]。在常染色体隐性疾病中，SMA作为最为常见的致死性疾病之一，在新生儿中的发病率高达1/10 000~1/6 000，且人群致病基因的携带水平约为1/60～1/40[4-5]。据报道，我国SMA携带水平在不同检测人群中也存在差异，约在1/72～1/39之间[6-10]。患儿家庭一般没有此类疾病的患者，所以患儿一经出生就给家庭和社会带来沉重的精神负担和经济负担。在超过95%的SMA患者中，存在SMN1基因的纯合性缺失[11]，以SMN1的第7和第8外显子（exon7、8，E7、E8）同时缺失或仅有SMN1 E7缺失为其具体表现，约5%的患者是由SMN1发生其他微小突变后杂合缺失引起。研究表明，造成SMA的首要原因是SMN1基因的缺失，因此检测SMN1基因的缺失成为SMA分子检测的首选方法[12]。本研究对孕妇进行SMA无症状携带者的筛查，对筛查阳性孕妇的胎儿进行产前诊断，寻求筛查和诊断SMA胎儿的新途径，预防SMA患儿的出生。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择2014年12月—2017年10月就诊于天津市中心妇产科医院产科门诊、接受常规产前检查孕中期孕妇162例作为研究对象。年龄22～34岁，平均年龄（28.8±2.6）岁；孕周 16～18 周，平均（17.2±0.3）周。夫妇双方均体健，无SMA相关临床表现。夫妇双方签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA的提取 取孕妇乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝外周血4 mL，利用离心柱法提取DNA，用分光光度仪测定DNA模板质量，-20℃保存以防DNA降解。

1.2.2 荧光定量聚合酶链式反应法（QF-PCR）进行SMN1 E7和E8测定 依据孟英韬等[13]的设计方案，针对SMN1和SMN2高度相似存在反向重复且仅有的5个特异性碱基差异的特点，设计出2种特异性引物分别为应用于检测存在于SMN1和SMN2第6内含子到第7内含子之间的4个碱基差异的引物1和应用于检测位于E8碱基差异的引物2。引物序列如下：引物1，上游5’-AGACTATCAACTTAATTTCTGATC-3’，下游 5’-CTGGTCTGCCTACTAGATAT-3’；引物 2，上游 5’-GTAATAACCAATGCATGTGAA-3’，下游 5’-CTACAACACCCTTCTCACAG-3’。

PCR反应条件为95℃预变性10 min，40个循环（以95℃变性15 s、58℃退火60 s为每个循环条件）。选择羧基荧光素（FAM）通道和绿色荧光蛋白（VIC）通道用于信号采集。PCR反应后数据处理，ΔCT的计算方法：ΔCT=CT_FAM-CT_VIC，ΔΔCT=ΔCT_Sample-ΔCT_Standard（样本 ΔCT减去 3个标准品ΔCT的平均值）。

SMN1 E7数据结果判读依据：E7ΔΔCT≤-0.55为未检出SMN1 E7缺失；-0.55＜E7ΔΔCT≤-0.45为临界值；-0.45＜E7ΔΔCT≤0.45 为 SMN1 E7 杂合缺失型；0.45＜E7ΔΔCT≤0.80为临界值；0.8＜E7ΔΔCT为 SMN1 E7纯合缺失型。SMN1 E8数据结果判读依据：E8ΔΔCT≤-0.55为未检出SMN1 E8缺失；-0.55＜E8ΔΔCT ≤-0.45为临界值；-0.45＜E8ΔΔCT≤0.45为 SMN1 E8杂合缺失型；0.45＜E8ΔΔCT≤1.5为临界值；1.5＜E8ΔΔCT为SMN1 E8纯合缺失型。

1.2.3 对筛查阳性携带者孕妇配偶进行SMN1 E7、E8检测对经QF-PCR筛查，基因型为SMN1 E7杂合缺失伴或不伴E8缺失孕妇定为阳性携带者，对其配偶进行SMN1 E7及E8检测。

1.2.4 采用QF-PCR对羊水标本进行SMN1缺失测定 对夫妇双方均为阳性携带者的孕妇进行羊水穿刺，抽取羊水10 mL，采用常规方法提取胎儿羊水DNA，采用QF-PCR对DNA模板SMN1 E7、E8缺失情况进行诊断。同时采用多重连接探针扩增技术（MLPA）对胎儿的基因缺失情况进行验证（本部分实验由金域医学检验所检测）。

2 结果

2.1 DNA提取的质量用离心柱法提取外周血DNA，浓度为 22.7～61.4 ng/μL，平均（36.8±12.1）ng/μL，OD260/OD280 在 1.75～1.89 之间。

2.2 QF-PCR对孕中期孕妇外周血DNA检测结果在162例孕妇中不存在SMN1 E7、E8同时纯合缺失情况。SMN1 E7杂合缺失6例，参照SMN1 E8的检测情况，这6例E7杂合缺失病例中孕妇编号分别为No.81、No.128、No.130的3例表现为合并E8杂合缺失，孕妇编号分别为No.18、No.89、No.91未发现E8缺失。故162例孕妇共检测出6例SMA致病基因携带者，携带者占样本总人数的3.70%（6/162）。在6例携带者中，编号为No.128和No.130的孕妇配偶同样为SMN1缺失的阳性携带者，E7和E8都表现为杂合缺失。编号为No.18、No.81、No.89和No.91的4例孕妇配偶全部表现E7、E8正常型。孕妇中阳性携带者以及其配偶的基因型检出结果见表1。No.89孕妇的QF-PCR曲线图见图1。

对父母均为SMN1 E7杂合缺失的高危胎儿DNA采用QF-PCR进行基因诊断，显示2名胎儿中No.128孕妇胎儿为纯合型患者（即SMN1 E7、E8均显示为纯合缺失），No．130孕妇胎儿基因型表现为与父母相同的SMN1 E7杂合缺失同时伴E8杂合缺失（即SMA致病基因携带者）。对上述2名胎儿同时采用MLPA方法进行胎儿基因型的验证，结果表明2名胎儿中No.128孕妇家庭的胎儿基因型为SMN1 E7、E8均为纯合缺失；No.130孕妇家庭的胎儿的基因型为SMN1 E7、E8均杂合缺失，其MLPA结果见图2。两种方法结果一致。

3 讨论

我国是出生缺陷高发国家，据2017年卫生部统计，我国每年出生缺陷率高达5.6%，其中单基因遗传病占出生缺陷的22.3%，是婴儿致死致残的重要原因。因此对单基因遗传病携带者的产前筛查及诊断具有重要的意义。SMA作为一种常见的常染色体隐性遗传病，给患儿家庭带来极其严重的经济和精神负担。本研究对162例孕妇进行SMN1缺失检测，发现SMN1缺失的携带率约为1/27，高于文献报道的1/72～1/39[6-10]，可能与检测样本量有限有关，也可能与天津地区高携带率有关，故对于天津地区的人群携带率需要进一步增加样本量进行研究。

表1 筛查SMA携带者及其配偶的基因型表现

SMN1基因缺失是造成SMA的主要原因，对SMN1缺失的检测方法主要有聚合酶链式限制性片段长度多态性分析技术（PCR-RFLP）、PCR结合变性高效液相色谱技术（PCR-DHPLC）和MLPA等。PCR-RFLP方法虽较为简单易行，但对检测SMN1杂合缺失尚存在局限性，仅能对SMN1基因纯合缺失的SMA患儿进行分子诊断[14]，因而不能应用于人群中进行SMA致病基因携带者的筛查；PCRDHPLC存在实验引物设计较为复杂、实验背景受重复片段干扰较大、结果判读困难等缺点，并且对实验检测条件要求高。MLPA技术是目前检测SMN1基因缺失的金标准，有准确度高、特异性强等优点[15]，不仅能检出SMN1基因的纯合缺失，还可对SMN1基因拷贝数进行定量分析[16]，但对DNA样本质量要求高、实验耗费时间较长、实验结果判读相对复杂，商品化试剂价格也相对高昂[6]，暂难以作为筛查方式在基层卫生机构及大规模人群中普及。QF-PCR因其简便、快速等优点成为检测基因缺失的又一重要方法，本课题组曾对5个SMA家系分别采用QFPCR和MLPA方法检测SMN1基因缺失情况，两种方法结果一致。本研究应用QF-PCR法对孕中期妇女SMN1 E7、E8的缺失情况进行筛查，在保持QFPCR法检测本身的成本低廉、实验快速准确、操作步骤简便、实验流程不易被污染、可对反应进行实时监控、结果判读较为直观等传统优势的同时[17]，依靠其完备的实验方案以及详尽的数据解读方法，使实验试剂各异、操作平台不同、实验优化不同等因素造成实验重复性差、实验结果难以通用识别的缺点得到基本克服，但本研究样本有限，我们将通过增加病例的数量以进一步研究该方法的敏感度和特异度，评估在人群中筛查的价值以及对产前诊断SMA胎儿的意义。该方法的局限性在于只能检测基因的缺失，对有SMN1基因突变的携带者无法识别，故对有SMA家族史的孕妇应采用QF-PCR法以及基因测序的方法联合筛查效果更好。

图1 No.89孕妇SMN1基因E7和E8的PCR曲线

图2 No.130孕妇胎儿MLPA图

本研究建立了SMA携带者筛查及对夫妇双方携带者家庭进行产前诊断的流程，采用QF-PCR方法先对孕妇SMN1 E7、E8的缺失情况进行筛查。对筛查出阳性的孕妇定义为携带者，然后对其配偶进行SMN1 E7、E8的检测，若其配偶是阴性的，征询父母的意见是否做产前诊断，对出生后的婴儿进行随访。若其配偶是阳性的定义为夫妇双携带者，对其胎儿进行羊水穿刺，采用QF-PCR方法诊断胎儿的基因型。本研究162例孕妇共筛查出6例SMA携带者，携带者占样本总人数的3.70%，对其配偶进行检测，有2例为夫妇双携带者。对这2例胎儿进行产前诊断，1例为纯合缺失，诊断为SMA患者，经遗传咨询父母决定终止妊娠。另1例诊断为携带者，经遗传咨询父母决定继续妊娠，孕妇于孕39周顺产，对婴儿进行体格检查未见明显异常。由此可见，采用规范的产前筛查及诊断流程对于SMA携带者夫妇做出适当的选择以及减少SMA患儿的出生都具有重要的意义。