广东省顺德地区6 503例孕中期羊水染色体核型结果分析*

罗小芳，黄柳萍，吴海燕，张秀群

(广东医科大学顺德妇女儿童医院产前诊断中心，广东佛山 528300)

染色体异常是自发性流产、死胎、性发育异常、先天性疾病等发生的重要原因，也是新生儿出生缺陷的重要原因。但染色体疾病缺乏理想的治疗方法，因此产前筛查及产前诊断胎儿染色体疾病非常重要。目前，染色体疾病的产前筛查方法主要包括血清学筛查、超声检查和无创产前基因检测(non-invasive prenatal testing， NIPT)等，产前诊断方法主要有染色体核型分析、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、染色体微阵列分析(chromosome microarray，CMA)、基于下一代测序的全基因组拷贝数变异(next-generation sequencing copy number variations，NGS-CNVs)检测等，而染色体核型分析仍然是染色体异常检测的金标准。因此，本研究通过对6 503例孕中期羊水穿刺产前诊断的分析，探讨羊水细胞异常核型发生的频率、类型与不同产前诊断指征之间的关系，评估羊水穿刺术诊断染色体疾病的临床价值，现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1 研究对象 选取2009年7月～2018年7月来本院产前诊断中心进行羊水穿刺染色体核型分析检查的孕妇6 503例，年龄17～52岁，其中<35岁4 047例，35～39岁1 923例，≥40岁以上533例。孕周15～26周，平均20+2周，依据具有产前诊断指征种类不同，分为以下7组：孕妇高龄(预产年龄≥35岁)；胎儿超声异常；孕妇血清学筛查高风险；不良孕产史，包括曾育染色体异常儿及结构畸形儿，两次或两次以上胚胎停育；夫妻一方染色体异常携带；NIPT高风险；其他原因(羊水过多/过少、孕期服药、病毒感染、接触致畸因子)等。所有孕妇及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 试剂和仪器 Illumina公司的NextSeqCN500测序仪，贝瑞和康血浆游离DNA提取试剂盒(磁珠法)，测序反应通用试剂盒，胎儿染色体非整倍体检测试剂盒(可逆末端终止测序法)，美国THERMO CO2培养箱，北昂LABB M9全自动染色体扫描仪及分析系统、美国CHANG Amnio羊水细胞培养基，以色列BIOAMF-2羊水细胞培养基。

1.3 方法

1.3.1 NIPT检测：抽取孕妇静脉血5 ml，提取血浆游离DNA，制备测序文库，NextSeqCN500平台测序，按照测序仪标准操作规程进行检测，运用生物信息分析技术获得检测结果。

1.3.2 羊水穿刺：孕妇在无菌、B超引导下行羊膜腔穿刺术，取羊水20 ml分装于两支无菌离心管，CHANG Amnio羊水细胞培养基和BIOAMF-2羊水细胞培养基双线常规T型瓶培养，常规收获、制片、G显带，每例标本按照ISCN(2013)标准分析30个分裂相，采集6个核型图。嵌合体至少计数50个核型。对所有行羊水穿刺的孕妇进行追踪随访。

1.4 统计学分析 实验结果采用SPSS21.0统计学软件，计数资料比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 羊膜腔穿刺术后并发症情况及细胞培养成功率 孕妇羊膜腔穿刺术后，随访1周，6 503例孕妇没有1例因穿刺引起流产及宫内感染。全部羊水细胞培养中，培养失败11例，细胞培养成功率达99.83%，首次细胞培养失败的病例择期重抽羊水后全部培养成功。

2.2 孕妇的产前诊断指征及染色体异常核型检出率 见表1。

表1 孕妇产前诊断指征与异常核型检出情况(n=6 503)

将不同的产前诊断指征分为七个组，本地区产前诊断指征主要是血清学筛查高风险(43.43%)和高龄孕妇(37.77%)。各组染色体异常检出率经χ2检验发现，高龄组与血清学筛查高风险组(χ2=0.147)，高龄组与不良孕产史组χ2=1.827，血清学筛查高风险组与不良孕产史组，差异无统计学意义(χ2=2.279，均P>0.05)；其余各组之间染色体异常检出率两两比较，差异均有统计学意义(χ2=7.411～997.801，均P<0.01)。

2.3 羊水细胞染色体核型结果 见表2。6 503例羊水细胞中，检出358例染色体异常核型，异常率为5.51%。染色体数目异常共264例(73.74%)：其中21三体占35.75%(128/358)，18三体占14.25%(51/358)，13三体占5.59%(20/358)；性染色体的数目异常占 18.16%(65/358)；染色体结构异常66例(18.44%)，主要为染色体易位、倒位、缺失和衍生等；另有嵌合体28例(7.82%)。

在358例异常核型中，NIPT高风险127例(35.47%)，血清学筛查高风险89例(24.86%)，孕妇高龄82例(22.91%)，超声异常36 例(10.06%)，夫妻一方染色体异常13例(3.63%)，不良孕产史7例(1.96%)，其他原因4例(1.12%)。

表2 胎儿羊水染色体异常类型与产前诊断指征分布

2.4 高龄孕妇胎儿染色体异常情况 本研究高龄孕妇2 456例，将其分为35～39岁组和≥40岁组两组，35～39岁组胎儿染色体异常检出率为2.70%(52/1 923)；≥40岁组胎儿染色体异常检出率为5.63%(30/533)，两组染色体异常经配对四格表资料的χ2检验，差异有统计学意义(χ2=11.059，P<0.01)。

2.5 NIPT高风险者的羊水染色体确诊结果 NIPT高风险病例205例，其中21三体、18三体和13三体高风险者分别为71例、29例和25例，性染色体异常58例，其他染色体异常22例。羊水细胞染色体核型确诊的21三体、18三体和13三体分别为57例、22 例(包含1例嵌合体)和11例，性染色体异常32例，其他染色体异常包括2例1号染色体缺失，1例6号染色体缺失，1例9号染色体三体，1例11号染色体重复(嵌合体)。本研究数据表明， NIPT对21三体、18三体和13三体的检测准确度分别为80.28%，75.86%和44.00%，对性染色体异常的检测准确度为55.17%，对其他染色体异常的检测准确度为22.73%。总体的筛查准确度为61.95%。

3讨论染色体异常可引起智力低下，器官畸形，生长发育迟缓，或者性腺发育不全等多种病症，目前临床上没有有效的治疗方法，因此严格把控产前诊断指征，有效地检出染色体异常儿，避免其出生，对优生优育具有重要的意义。本研究6 503例孕妇中，无1例因为羊水穿刺而导致胎儿流产及宫内感染，这可能与本中心严格把控介入性产前诊断指征，质量控制深入各个环节有关。羊水细胞培养成功率高于马骞等[1]报道的96.9%。11例培养失败样本中，3例为污染，可能为操作过程中带入杂菌；3例有陈旧性出血，抽出羊水为褐色；5例为无细胞贴壁，可能为细胞活力不足。

本研究中羊水细胞染色体异常检出率为5.51%，高于金克勤等[2]报道的3.19%，与郭芬芬等[3]报道的相近。其中，21三体在全部非整倍体中占48.5%，与文献报道相近[4]。本研究检出嵌合体28例，嵌合体发生机制为染色体不分离、染色体丢失、染色体体内复制及染色体断裂与复位重接等。传统研究认为，羊水染色体嵌合体可通过脐带血染色体检查，排除假性嵌合体或母血污染所致。但是众所周知，羊水细胞来源于胎儿脱落细胞，脐带血来自于外周血淋巴细胞，两者来源不同，导致结果可能不一致。本研究嵌合体中22例同时行单核苷酸多态性微阵列基因芯片(single nucleotide polymorphism microarray gene chip，STR)检查，结果显示均与羊水核型结果嵌合比例大致相同；6例同时行STR及高通量测序技术的基因拷贝数变异(NGS-CNVs)，结果显示3例与羊水结果相同，3例结果无异常。这是因为此3例嵌合体嵌合比例均较低，而STR与拷贝数变异(copy number variations，CNVs)不能有效地检出低于10%的嵌合体。因此，当羊水核型结果与STR及CNVs结果不一致时，建议病人做荧光原位杂交技术(FISH)验证，以确定是否真假嵌合。

我们将产前诊断指征分为七个组，对各组染色体异常检出率行χ2检验发现，除高龄组与血清学筛查高风险组、高龄组与不良孕产史组、血清学筛查高风险组与不良孕产史组外，其余各组之间检出率两两比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)，说明各组之间染色体异常检出率相差较大，尤其是NIPT高风险组与其他各组的差异，这表明了NIPT在产前筛查中的重要性。但是，产前工作中仍应该重视并严格把控每一项产前诊断指征。

血清学筛查方法目前仍然是国内产前筛查最常用的方法，本数据中其染色体异常检出率为3.15%，明显高于普通人群中胎儿染色体异常检出率[5]，说明产前血清学筛查非常重要。但其假阳性率非常高，随着分子遗传技术的发展，传统的血清学筛查方法可能将逐步被替代。

近年来，高龄孕妇不断增加，而胎儿染色体异常风险会随着孕妇年龄的增长不断上升。我们统计到高龄孕妇2 456例，占穿刺总数的37.77%，检出了染色体异常82例，其中胎儿21三体发病率为1.43%(35/2 456)，远远高于新生儿中唐氏综合征发生率(0.14%)，18三体发病率为0.45%(11/2 456)，也远高于新生儿18三体发生率0.03%。宋伟等[6]对6 047例高龄孕妇胎儿染色体核型结果分析发现，当存在单独年龄因素时，预产期年龄<40岁的孕妇，其发生胎儿染色体异常的风险显著低于预产期年龄≥40岁的孕妇。本研究结果与之相符，因此采用恰当的产前筛查技术有助于提高此类人群的产前诊断效率。

本院因羊水过多/过少、孕期服药、病毒感染、接触致畸因子等行羊水穿刺的占比较高，这可能与地区风俗、气候等有关。虽然其染色体异常检出率只有 0.62%，但仍不容忽视。

胎儿超声异常主要包含超声软指标异常和胎儿解剖结构异常，两者均与染色体异常密切相关[7]。本研究中，胎儿超声异常组染色体异常检出率为17.22%，远远高于张军辉等[8]报道的7.33%，说明产前超声检查对顺德地区诊断染色体疾病具有重要意义，并且超声检查在整个孕期具有临床指导意义[9]。当胎儿超声异常时，应建议孕妇行介入性产前诊断，以确定胎儿染色体是否正常，必要时采用分子遗传学技术，明确胎儿是否有微小片段的异常；对于胎儿超声异常而其染色体及CNVs结果均正常者，必要时行全外显子测序，以明确胎儿是否有基因突变或者异常，指导生育。

本研究中，夫妻一方染色体异常组检出率高达37.14%，主要表现为常染色体易位及倒位。染色体平衡易位携带者可以形成18种合子，其中16种为部分三体或部分缺失，可引起死胎、流产或胎儿畸形。染色体倒位携带者可以形成4种合子，其中2种为部分重复或部分缺失的重组染色体组成。这些重组染色体的重复或缺失的片段基因有差异，导致配子形成障碍或者形成畸形的配子。因此，夫妇任何一方为染色体异常携带者，妊娠期必须进行必要的产前诊断，以确定胎儿是否有染色体异常。

目前，NIPT广泛用于产前筛查，主要有对21三体、18三体、13三体及性染色体等的非整倍体筛查，也有对一些染色体的微缺失筛查，如何敏等[10]对胎儿的Y染色体微缺失筛查。本研究中，NIPT产前筛查21三体，18三体和13三体诊断符合率分别为80.28%，75.86%和44.00%，与左娟等[11]的报道相近，远低于CHEUNG等[12]的报道。性染色体的诊断符合率为55.17%，也低于相关报道[13]。究其原因，限定性胎盘嵌合体、母体染色体异常、孕妇患肿瘤、胎儿胎盘染色体不一致等状况都可能影响NIPT的检测结果。例如，当胎儿染色体正常而限定性胎盘嵌合体的胎盘细胞染色体异常时，会导致NIPT的假阳性结果；相反，当胎儿细胞染色体异常而胎盘染色体正常，则可能导致NIPT的假阴性结果。因此，NIPT技术在临床上的应用有其适应症、慎用症及禁忌症，目前仍存在很多不足，不能完全取代有创产前诊断。

综上所述，对具有明确产前诊断指征的孕妇行羊膜腔穿刺术，进行羊水细胞染色体核型分析非常重要，可有效地检出染色体异常胎儿，避免其出生，提高人口素质。对于高龄孕妇，尤其是≥40岁的高龄孕妇，进行产前诊断非常必要。NIPT 对筛查胎儿染色体疾病准确率较高，但只是筛查手段，不能完全代替羊水细胞核型分析。