HPLC-MS/MS法检测骨髓移植患者全血环孢素A(CsA)浓度及与AM1和AM4N代谢产物的相关性研究*

王 磊，孙文利，刘 瑞，王红春，刘红星，2

(1.河北燕达陆道培医院，河北三河 065201；2.北京陆道培血液病研究院，北京 100176)

关键字：环孢素；高效液相色谱-串联质谱法；血药浓度；代谢产物

环孢素A(cyclosporine A，CsA)为多肽结构，主要作为免疫抑制剂使用，用于骨髓移植患者的抗排异和移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD的治疗和预防[1-2]。由于CsA治疗窗窄，毒性反应大，易导致移植失败，进行CsA血药浓度监测就显得尤为重要。目前监测CsA血药浓度的方法较多[3-10]，高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS法)[6-10]作为CsA血药浓度监测的金标准，在欧美国家临床实验室被广泛使用，较为著名的有Mayo clinic，Lab Test Directory，Quest Diagnostics和西雅图移植中心。但由于其仪器昂贵，自动化程度低，需要专业的人员操作，故在国内临床实验室应用较少。CsA在患者体内有30多种代谢产物，代谢产物的量和活性各异，目前尚无相应的体内实验证明其差异[1-10]。其体内代谢产物研究最多的有5种，分别为AM1，AM1c，AM4N，AM9和AM19，含量最多的为AM1，含量最少的为AM4N，两者在患者个体内代谢情况目前尚无详细数据可查，对其研究就显得尤为必要。本文就CsA在骨髓移植患者体内代谢进行研究，采用HPLC-MS/MS法对移植患者各时间点全血样本进行CsA和AM1及AM4N血药浓度检测，确定其相应关系，为研究CsA个体内代谢差异提供理论依据；同时对不同移植患者全血样本进行CsA和AM1及AM4N血药浓度检测，确定其相应关系，为研究CsA个体间代谢差异提供理论依据。

1材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 CsA个体内代谢：选择2018年6月21日前来我科做CsA药物代谢研究的骨髓移植患者黄某，男，年龄15岁，诊断为急性淋巴细胞白血病(ALL)，患者每天早8点晚20点服药，分别于服药后0，1，2，3，4，6，8，10和12 h抽取静脉血，共收集其18份全血样本用于CsA血药浓度测定，用HPLC-MS/MS方法对其全血样本进行CsA及AM1和AM4N浓度检测。

1.1.2 CsA个体间代谢：随机选择2018年6月21日前来我科做CsA药物代谢研究的骨髓移植患者20例全血样本，采用HPLC-MS/MS方法对其全血样本进行CsA及AM1和AM4N浓度检测。

1.2 试剂与仪器 试剂与仪器详见本实验室前期建立的同时测定骨髓移植患者全血CsA和AM1[17]；AM4N(HPLC Grade，Toronto Research)。

1.3 方法 本实验室前期已建立同时测定骨髓移植患者全血中CsA和AM1的方法[8]，同时AM4N的质谱条件为AM4N：m/z 1 206.1～1 188.9，DP：70V，CE：19V；其它质谱条件和色谱条件与CsA和AM1相同。

1.4 统计学分析 利用SPP 16.0分别对个体内与个体间全血CsA，AM1和AM4N进行相关性分析，同时利用雷达图进行各自比率分析。

2结果

2.1 色谱质谱行为 在以上色谱质谱条件下，测得AM4N二级碎片离子质谱图，见图1。CsA，AM1，AM4N，CsD质谱色谱图，见图2。AM4N的保留时间为3.57 min，以CsD为内标，AM4N峰面积与CsD峰面积比值(Y)对AM4N浓度(X)进行线性回归，得AM4N回归方程：Y=0.001 89X-0.009 65(r=0.993 7)，经方法学考察线性范围、回收率、精密度、基质效应及稳定性均符合检测要求，最低定量限为1.0 ng/ml，可用于定量分析。各峰型良好，无杂质峰干扰。

图1 AM4N的二级扫描碎片离子图 图2 CsA，AM1，AM4N及CsD质谱色谱图

2.2 HPLC-MS/MS法同时检测个体内CsA，AM1和AM4N血药浓度结果 该骨髓移植患者不同时间点的18例全血样本CsA，AM1和AM4N血药浓度检测结果，见图3。由图3可知，该骨髓移植患者CsA代谢产物AM1在不同时间点含量均较大，而代谢产物AM4N在不同时间点含量均较小，这和以往研究结果一致[1-8]。对不同时间点的CsA，AM1和AM4N比率结果作雷达图进行各自比率关系分析见图4。可见，该患者一天内不同时间点AM1/CsA的比率大，同时波动也较大(0.28～1.34)，而AM4N/CsA和AM4N/AM1相应的比率关系较好，比率范围分别为0.04～0.14和0.06～0.23。由图4可知，也可进一步说明AM1在CsA代谢产物中占比较大，而AM4N在CsA代谢产物中占比较小。对三者进行相关性分析(见图5)可知CsA和AM1的相关性较差(r=0.79)，与本实验室前期研究结果一致[7-8]，而AM4N和CsA及AM1在该患者体内一定程度上存在相关性(r>0.9)。

图3 HPLC-MS/MS法检测CsA，AM1和AM4N血药浓度结果 图4 CsA，AM1和AM4N比率

图5 相关性分析

2.3 随机选择的骨髓移植患者20例全血样本CsA，AM1和AM4N血药浓度检测结果 见图6。由图6可知，随机选择的20例骨髓移植患者样本CsA代谢产物AM1在不同个体检测值波动较大(3～146)，而代谢产物AM4N在不同个体检测值波动较小。对不同个体间的CsA，AM1和AM4N比率结果作雷达图进行各自比率关系分析见图7。可见，不同个体间AM1/CsA的比率波动也较大(0.05～1.20)，而AM4N/CsA和AM4N/AM1相应的比率关系较好，比率范围分别为0.009～0.05和0.01～0.39。由图7可知，也可进一步说明AM1在CsA代谢产物中占比较大，而AM4N在CsA代谢产物中占比较小。对三者进行相关性分析(见图8)可知，个体间CsA和AM1的相关性较差(r=0.59)，AM4N和CsA及AM1在个体间不存在相关性(r<0.5)。

图6 HPLC-MS/MS法检测不同个体间CsA，AM1和AM4N血药浓度结果 图7 不同个体间CsA，AM1和AM4N比率

图8 个体间结果相关性分析

3讨论本文在王磊等[8]人的“HPLC-MS/MS法在骨髓移植患者全血CsA及AM1浓度测定中的应用”一文的基础上，增加了CsA的代谢产物AM4N的检测，明确了CsA在骨髓移植患者个体内不同时间点的代谢差异，进一步确定了AM1是CsA在骨髓移植患者体内代谢的最主要代谢产物，其占比高，含量大，且与CsA浓度的相关性较差。同时发现AM4N在CsA代谢产物中占比小，含量低，但其与CsA和AM1的相关性却较好。同时，通过对个体间的CsA，AM1和AM4N血药浓度检测，也进一步证实了AM1是CsA的主要代谢产物，其含量大，但是与CsA的比例关系差别较大，同时有文献报道AM1又具有生物活性[16-17]，这就解释了为什么CsA在移植患者中有效浓度会有差异，AM4N在个体间的代谢比率有差异，但其总含量小，生物活性也低，对CsA有效血药浓度范围的影响较小。总之，不论CsA在个体内还是个体间代谢，其主要代谢产物AM1含量都较高，且差异较大，严重影响CsA有效血药浓度范围，而AM4N含量都较小，不影响CsA有效血药浓度范围。本文通过对骨髓移植患者个体内和个体间的CsA和AM1及AM4N血药浓度的检测，说明了CsA在骨髓移植患者体内代谢存在个体差异，同时也要求检测CsA血药浓度的检测方法必须特异性强[9-10]，才能避免CsA代谢产物的干扰。