慢性乙型肝炎肝衰竭患者外周血Th22细胞和IL-22的变化

陈敏，张宏宇，朱珉之，申红玉，刘小琴，*

（常州市第三人民医院，1.检验科，2.肝病研究所，江苏 常州213003）

我国是乙型肝炎病毒（HBV）感染大国，HBV感染是肝衰竭发生的主要原因之一。病理学检查虽为诊断肝衰竭的金标准，但考虑到肝衰竭患者病情严重，常有凝血功能障碍，很难耐受肝脏穿刺等有创操作。目前临床上，ALT、AST、总胆红素和凝血酶原活性（prothrombin activity，PTA）可作为肝脏炎症及损伤的评价指标，但特异性均不强，在重症患者中容易出现“胆酶分离”现象。终末期肝病模型（model for end-stage liver disease，MELD）各种评分系统被用于评估肝衰竭患者的病情严重程度和疾病预后，但计算较为繁琐。因此，寻找新的标志物用于肝衰竭患者的早期诊断及病情评估具有一定意义。

辅助性T细胞在慢性HBV感染所致的肝功能损伤及肝衰竭过程中发挥重要作用，我们的前期研究显示，Th17细胞及相关因子参与慢性HBV感染进程［1］。Th22细胞是一种新发现的辅助性T细胞，多项研究［2-6］表明，Th22细胞及IL-22与多种肝脏疾病的发生发展密切相关。因此，本研究主要观察Th22细胞及其相关因子在HBV感染肝衰竭患者外周血中的变化，初步评价其在肝衰竭患者中的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集我院2015年6月至2016年2月住院的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者20例（CHB组），其中男14例，女6例，平均年龄（48.4±11.2）岁；HBV相关肝衰竭患者20例（肝衰竭组），其中男15例，女5例，平均年龄（50.2±12.5）岁。另以体检健康者20例作为对照组，其中男15例，女5例，平均年龄（48.5±11.6）岁。CHB患者诊断标准符合2015年中华医学会肝病学分会和中华医学会感染学分会联合修订的《慢性乙型肝炎防治指南》［7］；HBV相关肝衰竭患者诊断标准符合2012年中华医学会感染学分会肝衰竭与人工肝学组和中华医学会肝病学分会重型肝病与人工肝学组联合制定的《肝衰竭诊治指南》［8］。所有病例入组前3个月，均未使用过免疫调节类药物，无合并HCV、丁型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、HIV感染和自身免疫性肝病，无原发性肝癌及肝脏转移性肿瘤。所有患者在入院初采集血液标本进行相关检测。

1.2 流式细胞术检测Th22细胞

采集肝素抗凝血5 mL，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMC），调整PBMC悬液细胞密度至5×106／mL，取100μL细胞悬液，加入等体积RPMI-1640稀释，应用佛波酯和离子霉素（美国eBioscience公司）联合刺激后，加入1μL布雷菲德菌素A（BD公司），37℃、5% CO2培养箱中培养4 h。取上述标本，加入FITC标记的CD4抗体（BD公司），充分混匀，4℃，避光30 min。加入100μL固定剂（BD公司）并孵育15 min；加入2 mL PBS，1 500 r／min离心5 min，倾去上清液，振荡重悬细胞；加入100μL破膜剂（BD公司）和10μL IL-17AAPC抗体（eBioscience公司）、10μL IFN-γ-PE抗体（eBioscience公司）和20μL IL-22-PerCP抗体（eBioscience公司），振荡混匀后孵育20 min；加入2 mL PBS洗涤，1 500 r／min离心5 min，去上清液；加入300μL PBS重悬细胞，应用BD公司FACSC流式细胞仪进行Th22细胞检测。根据前向角FSC和侧向角SSC参数圈定淋巴细胞，再用CD4-FITC和IFN-γ-PE分出P1群（IFN-γ-CD4+）细胞，再从P1群细胞中分离出Th22（IFN-γ-IL-17-IL-22+CD4+）细胞。

1.3 ELISA法检测血浆IL-22浓度

应用双抗体夹心ELISA法检测血浆IL-22浓度（ELISA试剂盒为美国eBioscience公司产品），以标准品浓度为横坐标，D值为纵坐标，计算出标准曲线的回归方程，将样本的D值带入方程式，计算出样本浓度。具体操作按试剂盒操作说明进行。

1.4 其他指标检测

ALT、总胆红素、HBV-DNA均为实验室常规开展项目。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析。实验数据经K-S检验呈正态分布，以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；连续变量相关性分析采用Pearson或Spearman相关分析；绘制受试者工作特征（receive operating characteristic，ROC）曲线并计算诊断敏感性和特异性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组一般资料及实验室指标比较

3组性别和年龄间的差异均无统计学意义（均P＞0.05）；肝衰竭组HBV-DNA水平虽高于CHB组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；肝衰竭组和CHB组ALT和总胆红素水平均明显高于对照组（均P＜0.01）；肝衰竭组总胆红素浓度显著高于CHB组（P＜0.01）。见表1。

表1 各组一般资料及实验室指标的比较 n＝20，±s

表1 各组一般资料及实验室指标的比较 n＝20，±s

a：P＜0.01，与对照组比较；b：P＜0.01，与CHB组比较

组别 男／女（例） 年龄（岁） HBV-DNA（lg拷贝／mL） ALT（U／L） 总胆红素（μmol／L）肝衰竭组 15／5 50.2±12.5 5.26±1.34 210.40±144.60a 309.10±161.54a，b CHB组 14／6 48.4±11.2 5.03±1.22 180.65±124.69a 31.55±12.78a对照组 15／5 48.5±11.6 19.75±5.45 10.2±3.37检验值 χ2＝0.17 F＝0.156 t＝0.554 F＝17.30 F＝63.51 P值0.918 0.856 0.582 0.000 0.000

2.2 3组患者外周血Th22细胞频数和IL-22浓度比较

流式细胞术检测结果显示，肝衰竭组Th22细胞频数明显高于CHB组及对照组（P ＝0.048，0.001）；CHB组Th22细胞频数虽高于对照组，但差异无统计学意义（P＝0.193）。见表2、图1。ELISA法检测结果显示，肝衰竭患者IL-22浓度显著高于CHB组和对照组（P＝0.013，0.000）；CHB组IL-22浓度虽高于对照组，但差异无统计学意义（P＝0.075）。见表2。

表2 各组患者外周血Th22细胞频数及IL-22浓度比较n＝20

图1 流式细胞术检测3组患者外周血Th22细胞频数

2.3 不同分期肝衰竭患者外周血Th22细胞和IL-22浓度差异

将肝衰竭患者分为早期（30%＜PTA≤40%）、中期（20%＜PTA≤30%）和晚期（PTA≤20%）3组。早期和中期肝衰竭患者Th22细胞频数和IL-22浓度虽高于晚期患者，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 不同分期肝衰竭患者外周血Th22细胞频数及IL-22浓度比较

2.4 外周血Th22细胞及IL-22预测肝衰竭发生的ROC曲线分析

将肝衰竭组和CHB组患者Th22细胞频数及IL-22浓度等数据绘制ROC曲线，见图2。Th22细胞在CHB患者中预测肝衰竭发生的ROC曲线下面积为0.655（95% CI：0.484～0.826），虽高于0.5，但差异无统计学意义（P＝0.094）；IL-22预测肝衰竭发生的ROC曲线下面积为0.753（95% CI：0.598～0.907），显著高于0.5，差异有统计学意义（P＝0.006）。IL-22预测肝衰竭最佳临界值为32.80 pg／mL，此时的敏感性为80.0%，特异性为65.0%，阳性预测值为69.57%，阴性预测值为76.47%，约登指数为0.725。

图2 Th22细胞和IL-22预测肝衰竭发生的ROC曲线

2.5 肝衰竭患者Th22细胞及IL-22与肝功能、HBV病毒载量的关系

Pearson相关分析结果显示，肝衰竭患者外周血Th22细胞频数与IL-22浓度呈正相关（r＝0.766，P＜0.01）。Pearson或Spearman相关分析结果显示，肝衰竭患者外周血Th22细胞频数、IL-22浓度与ALT表达水平不相关（均P＞0.05），与lg HBV-DNA水平也不相关（均P＞0.05），与总胆红素浓度呈正相关（r＝0.420，0.476，均P＜0.05）。

3 讨论

Th22细胞为新近发现的一种CD4+Th亚群，分泌IL-22和TNF-α，但不分泌IFN-γ和IL-17，具有表型CCR4+、CCR6+、CCR10+的特点，其关键转录因子为芳香烃受体。IL-22主要来源于Th22细胞，Th1和Th17细胞也可少量分泌IL-22。IL-22受体包含一个IL-22R1链和一个IL-10R2链，IL-22结合的特异性依赖于IL-22R1，而IL-10R2则介导细胞内的信号转导。IL-22R1表达于肝脏、皮肤、肺、肾脏、胰腺等组织，T细胞、B细胞、NK细胞及单核细胞等免疫细胞缺少IL-22R1的表达。因此，Th22作用特点有别于其他淋巴细胞，其作用对象非免疫细胞，而是肝脏、皮肤等表达IL-22R1的组织细胞［9］。

既往研究表明，Th22细胞在自身免疫性疾病及肿瘤中发挥重要作用［10-11］，表明Th22可能参与机体的免疫应答及炎症反应，而在CHB活动期常伴有免疫系统的激活和肝组织炎症损伤。目前认为，IL-22在HBV感染的肝脏疾病中是一把双刃剑，既有促炎作用，也有保护肝脏作用，究竟发挥什么作用，可能依赖于肝脏特异性的微环境。在急性HBV感染时，IL-22可能发挥促炎作用，帮助机体清除HBV，但同时也会引起肝细胞损伤；在HBV慢性感染进程中，IL-22可能发挥保护作用，即促进肝细胞分化和生存来补偿长期慢性炎症引起的肝损伤［12］。

本研究结果显示，CHB肝衰竭患者外周血Th22细胞频数和IL-22浓度高于健康对照组，与其他研究报道一致［4-6］，提示Th22细胞和IL-22可能在肝衰竭进展中发挥一定作用。已有研究表明，IL-22通过活化下游通路信号分子及STAT3，在ConA诱导的肝损伤小鼠模型中发挥保护作用［13］。慢性HBV感染进程中，由炎症细胞生成的IL-22可通过STAT3信号通路促进肝祖细胞增殖［14］。Xing等［15］研究发现，在GaIN／LPS诱导的急性肝衰竭小鼠模型中，应用rhIL-22治疗后，小鼠ALT、总胆红素降低，死亡率显著下降；进一步研究发现rhIL-22治疗可增加肝脏还原型谷胱甘肽水平，降低丙二醛含量，降低血清TNF-α和肝脏Caspase-3的活性，rhIL-22可通过激活STAT3上调Bcl-xL，HO-1和Ref-1因子的表达，提示IL-22在GaIN／LPS诱导的肝损伤中可通过抗凋亡、抗氧化和抗炎症等方式发挥保护作用。因此，我们推测慢性HBV肝衰竭患者中Th22和IL-22主要是代偿性增高，以减少肝脏损伤程度。

由于本研究样本量较小，肝衰竭早期和中期患者外周血Th22细胞频数和IL-22浓度虽高于晚期患者，但差异无统计学意义。随着肝衰竭的进展，Th22细胞和IL-22呈下降趋势，我们推测，可能与机体代偿能力有关。CHB至肝衰竭早期这个过程中，机体及肝脏具有一定的代偿能力，损伤及炎症反应可刺激Th22细胞和IL-22的产生并发挥保护作用。而到了肝衰竭中晚期，随着肝硬化、腹腔积液、肝性脑病等症状的出现，机体免疫功能及代偿能力都会有所下降，当损伤和炎症反应刺激时，Th22细胞和IL-22释放减少，其水平比正常人还低。

ROC曲线分析显示，Th22细胞在CHB患者中预测肝衰竭中的价值有限，而IL-22曲线下面积达到0.753（95% CI：0.598～0.907），提示IL-22可作为CHB预测肝衰竭发生的一个较好指标。相关性分析结果显示，肝衰竭患者外周血Th22细胞频数、IL-22浓度和病毒复制指标HBV-DNA无相关性。Zhang等［16］研究发现，对HBV转基因小鼠注射单剂量的IL-22，将使得肝脏促炎基因表达增加，但病毒表达水平无变化，提示IL-22不直接抑制HBV病毒的复制，这也可以解释CHB肝衰竭患者Th22细胞频数和IL-22浓度与HBV-DNA无相关性。本研究结果显示Th22细胞频数和IL-22浓度在肝衰竭患者中与ALT水平不相关，但与总胆红素呈正相关。由于IL-22在肝细胞损伤时代偿性增高，因此IL-22与肝脏损伤程度指标总胆红素呈正相关，而与ALT不相关主要考虑可能是肝衰竭患者ALT水平与肝脏炎症及损伤并不一定相关。

综上所述，Th22细胞及相关因子IL-22在CHB肝衰竭患者中异常表达，可能参与了肝衰竭的发病机制。IL-22可作为CHB患者肝衰竭发生的一个预测指标。监测肝衰竭患者外周血Th22细胞频数和IL-22浓度对肝脏损伤程度的判断具有一定意义。今后我们将进一步扩大样本量，动态观察治疗前后Th22细胞和IL-22的变化，评价其在疾病疗效及预后中的价值。