胰蛋白酶酶解制备卵转铁蛋白源抗菌活性肽条件的研究

吕瑜峰，佟永薇，周志江

（1.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134；2.天津市食品研究所有限公司，天津301609；3.天津大学化工学院，天津300072）

卵转铁蛋白（ovotransferrin，OVT）是一种易溶的蛋清非结晶蛋白，约占鸡蛋清蛋白重量的12%～13%，分子量为77 kDa～80 kDa[1-2]。卵转铁蛋白具广谱抗菌性，可拮抗许多微生物，包括假单胞菌（Pseudomonas）、大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）和霍乱弧菌（Vibriocholerae）等致病菌[3-4]，其OTAP-92 片段具抑菌活性，对革兰氏阳性菌和阴性菌都具有较强的抗菌活性，其通过进入细菌的内膜从而导致离子选择性渗透继而引发逸散作用[5]达到抗菌目的；同时也刺激宿主淋巴细胞自我增殖，达到抑制致病菌入侵，促进机体免疫力增强[6-7]。

如今，各种来源的抗菌活性肽都已成为研究热点，活性肽在完整的蛋白质结构中并没有生物活性，只在胃肠消化或酶解后，才可发挥一定的生理作用[8]，其活性功能由肽段的氨基酸种类、排列方式等决定[9]。Tomita 等发现了牛乳铁蛋白水解物中所含有的抗菌多肽具有抑菌活性[10]，Haney 等也发现了牛乳铁蛋白N 端存在一种阳离子抗菌肽-lactoferrampin[11-13]。抗菌活性肽的来源较广泛，动物和植物蛋白质中均可获得[14]，卵转铁蛋白与乳铁蛋白具有一定的生物同源性，也具有极其相似的生物活性，如抑制形成游离基、铁的转移、抑菌性等；卵转铁蛋白酶解后也可得到具有抗菌活性的多肽，且活性与其他来源铁蛋白相似[15-16]。抗菌肽具有广谱抗菌活性，一般来源为哺乳动物的抗菌肽具有广泛的抗菌谱，除具有抗细菌、真菌活性外，还具有抗病毒活性，其杀伤作用也对癌细胞、支原体及螺旋体有用[17]；Ibrahim 等获得了具抗菌性的卵转铁蛋白酶解产物，并初步研究该抗菌活性肽的制备方法[18-21]。目前采用较多地从动植物体中直接分离纯化或者应用基因工程技术合成抗菌肽的方法，成本很高，而采用酶解蛋白技术制备抗菌肽，成本低廉，快速简便，是获得抗菌活性肽的最佳途径之一。OVT 兼具营养性和功能性，易吸收且安全无毒副作用，可作为工业化的免疫功能因子、营养强化剂、食品添加剂[22-23]等添加到食品或保健品中，应用前景广泛。

本研究以两步醇析法从鸡蛋蛋清中提取的卵转铁蛋白为材料，选择胰蛋白酶酶解生产抗菌肽，选取大肠杆菌抑菌率为观察指标，设计正交试验获得酶解产生抗菌活性肽的最佳条件，为之后的中试研究提供有效的参考工艺。

1 材料及方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

天津商业大学生物技术与食品科学学院生物下游工程实验室以乙醇沉淀法（已获专利授权）获得的OVT 制品[24-25]；大肠杆菌（E.coli）K12：天津商业大学生物技术与食品科学学院微生物实验室提供。

1.1.2 试剂

胰蛋白酶：Sigma 公司；氯化钠（分析纯）：天津市博迪化工有限公司；蛋白胨（peptone）、酵母粉（yeast extract）、琼脂粉（agar powder）：Thermo Fisher Scientific 集团旗下英国Oxoid 公司。

1.2 仪器与设备

3-18K 离心机：德国Sigma 公司；A R1140 电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；滤膜（0.22μm）：MILLIPORE 公司；FDU-810 型EYELA 冷冻干燥机：日本东京理化公司；振荡培养箱：哈东联有限公司；HVE-50 型蒸汽灭菌器：日本哈雅玛有限公司；SW-CJ-1F 超净工作台：苏州安泰有限公司；Biosceen C MBR 自动微生物生长分析仪：IT'S Science Corporation Ltd.，Finland。

1.3 方法

1.3.1 卵转铁蛋白酶解获取抗菌活性肽条件的优化

参照文献[26-27]确定主要影响抗菌肽获得的因素有：温度、pH 值、底物浓度、酶与底物浓度比、酶解时间5 个因素，结合实际情况各因素选取3 个条件，应用L18（35）设计正交试验，试验因素水平设计如表1，以酶解产物对大肠杆菌抑菌效果作为评价指标，选取最佳酶解条件。

表1 L18（37）因素正交试验设计表Table 1 L18（37）factor level table

以获得的卵转铁蛋白粗提物为原料，按表1的条件分别经胰蛋白酶酶解，反应总体积为5 mL，酶解完成后立即迅速加温置于80 ℃恒温水浴下10 min 使酶失活终止酶反应，冷却后4 ℃低速离心30 min 获得上清液，将上清液冷冻干燥即得卵转铁蛋白酶解物，-20 ℃冷冻保存。

1.3.2 卵转铁蛋白酶解物抑菌率的测定

1.3.2.1 大肠杆菌cfu-OD600曲线的绘制

根据平板菌落计数法[28-29]，无菌条件下将1 mL 已用无菌生理盐水（0.9%）稀释的大肠杆菌菌液倒入已倒好的固体LB 培养基[胰蛋白胨（tryptone）10 g/L、酵母提取物（yeast extract）5 g/L、氯化钠（NaCl）10 g/L，调节pH 达到7.2～7.4]平板中进行涂布均匀，待基本渗透完全，放入37 ℃培养箱中培养48 h，记录每小时菌落数，计算相应菌液浓度（cfu 值），同时测定菌悬液OD600nm值，平行3 次后，绘制cfu-OD600标准曲线[单位体积菌悬液所形成的菌落数（cfu 值）为横坐标，相应浓度菌悬液OD600nm值为纵坐标]。

1.3.2.2 大肠杆菌生长曲线测定

1）无菌条件下将斜面保藏的大肠杆菌转接至营养琼脂斜面37 ℃下活化（培养24 h）2 次。

2）挑取活化后的大肠杆菌接种于LB 液体培养基，37 ℃下培养为菌悬液。

3）以107cfu/mL 浓度接种2）中培养的菌悬液至LB液体培养基培养板（Bioscreen C 仪器专用）中，设定温度37 ℃，中速振荡（120 r/min），波长600 nm，使用Bioscreen C 自动微生物生长分析仪测定大肠杆菌生长曲线（时间为横坐标，吸光度值为纵坐标）。

1.3.2.3 卵转铁蛋白源抗菌肽对大肠杆菌的影响

首先，分别用无菌水配制正交试验获得的18 个冻干样品成3 mL 液体样品，以0.22 μm 膜过滤除菌；之后取1 mL 上述液体样品加入8 mL 已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，再加入1 mL 已活化并稀释至107cfu/mL 的大肠杆菌菌液，混匀备用。阳性对照以无菌水替代抗菌肽样品（加入氨苄青霉素浓度为50 μg/mL），设生理盐水为阴性对照，取上述混匀液400 μL 加入已设定好的蜂窝板（Bioscreen C 仪器专用）孔中，每个样品重复3 个孔样，设定温度37 ℃、培养时间32 h（设备提前预热半小时）、波长600 nm，使用Bioscreen C 自动微生物生长分析仪测定卵转铁蛋白酶解物对大肠杆菌生长的影响。

2 结果分析

2.1 大肠杆菌生长曲线和菌落数-吸光度标准曲线（cfu-OD600）

根据1.3.2.1 述试验方法操作，得到cfu-OD600标准曲线如图1。

图1 大肠杆菌菌落数与吸光度关系图Fig.1 The diagram between the number of E.coli and the absorbance

图1中，吸光度值与大肠杆菌浓度呈线性关系，方程为y=0.072 8x+0.005 7，相关系数R2=0.989。

根据1.3.2.2 述试验方法操作，将活化后大肠杆菌菌悬液接种于LB 培养基培养板，以液体培养基为对照，设定600 nm 检测波长，使用全自动生长曲线测定仪测定大肠杆菌生长曲线，得到相应时间段的OD600值，分析数据得出大肠杆菌生长曲线如图2。

由图2中大肠杆菌生长曲线可以看出大肠杆菌的生长情况，0～1.5 h 之间为延迟期，在2.5 h 后进入对数生长期，生长速率逐渐增大，17 h 后生长速率逐渐减小，17 h～26 h 吸光度基本维持稳定进入稳定期，之后就逐步进入衰减期。因此研究中讨论抗菌肽对大肠杆菌生长抑制作用选取大肠菌群进入生长稳定期后的抑制情况进行分析，主要选择0～20 h 之间的数据进行分析。

图2 大肠杆菌生长情况Fig.2 The growth curve of E.coli

2.2 卵转铁蛋白酶解物抑菌性研究

根据1.3.2.3 的试验设计，检测大肠杆菌对数生长期菌液浓度，分析卵转铁蛋白源抗菌活性肽的抑菌情况，获得各组卵转铁蛋白源抗菌肽在20 h 时对大肠杆菌生长抑制作用的数据，计算获得各组的抑菌率见表2。

其中试验E3、E5、E11、E15 条件下获得的卵转铁蛋白酶解物可以看出明显抑制大肠杆菌生长的作用，其他试验条件下得到的卵转铁蛋白酶解物对大肠杆菌的作用及其微弱。抑菌率较高的试验组从大到小依次为E15，E3，E11，E5，E10。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal experimental results and range analysis

表2中各试验组的卵转铁蛋白源抗菌肽终浓度见表3。

表3 不同试验条件下得到的卵转铁蛋白酶解物浓度Table 3 The concentration of antimicrobial peptide under different experimental conditions

卵转铁蛋白源抗菌肽的抑菌率与试验组获得的抗菌肽终浓度密切相关，其中E5、E15 试验条件下获得的卵转铁蛋白源抗菌肽含量最高；E16、E17、E4、E3含量次高，但较E5，E15 含量下降非常明显。E15 条件下获得的抗菌肽浓度较高，为10.47 mg/mL，说明此条件得到的酶解物成份对大肠杆菌抑菌效果较好。

详细考察比较上述5 个（E15、E3、E11、E5、E10）高抑菌率试验组卵转铁蛋白源抗菌肽随时间对大肠杆菌的抑制作用情况见图3。

图3 不同培养时间卵转铁蛋白酶解物对大肠杆菌生长的影响Fig.3 Effects of ovotransferrin hydrolysates on the growth of E.coli at different culture time

由图3可以看出，随着大肠杆菌培养时间不断增加，抑菌率也渐渐增大，随后逐步趋于稳定，E15 试验条件获得的抗菌肽在培养17 h 即可到达抑菌高峰，为87.18%，其他条件获得的酶解物到达抑菌最强效果时间较E15 延后，E15 试验条件获得的抗菌肽不但抗菌作用迅速而且抗菌效果强。

由表2数据分析可以得到抑菌率最优组合为pH 值8.5，温度55 ℃，底物浓度30 mg/mL，酶底比1∶300（U/mg），酶解1.5 h；另外，从极差分析还可以看出，pH 值对抑菌率的影响最大。

为进一步分析各因素对试验结果影响的显著性，对试验结果进行方差分析，结果见表4。

表4 方差分析结果Table 4 The results of variance analysis

由表4可知：pH 值、底物浓度、酶与底物比对试验结果影响显著，其中pH 值、底物浓度极其显著（P＜0.01）。

3 讨论

目前抗菌肽的具体抗菌机制还在研究中，虽然种类繁多的抗菌肽在组成结构上或构象上有所不同，但抗菌活性都较明显，其主要作用在细胞膜磷脂双分子层，脂质双分子层表面是带有负电荷的，与肽段上带有的正电荷相互作用形成膜通道，致使细胞内容物外流，导致细菌细胞凋亡。文中试验采用的卵转铁蛋白抗菌活性肽混合物样品是通过胰蛋白酶酶解OVT 获得的，之后为更好的进行机制研究可以考虑进一步采用超滤的方法进行初步分离，截留分子量较小的肽段，同时将没有水解的大蛋白及杂质除去，随后再用柱层析进行初步分离纯化获得纯度较高的抗菌肽样品，并研究其化学结构和组织构象。

禽蛋作为来源充足的大宗食品，可以成为抗菌肽的良好来源，卵转铁蛋白抗菌活性肽作为一种安全的、新型的抗生素替代物、天然的防腐剂可以广泛的在食品行业、化妆品行业中得到应用，从卵转铁蛋白中酶解获得抗菌肽无毒、易吸收且高效。跟随生物技术特别是蛋白质工程和酶工程的不断发展，将会有更多品类的抗菌肽得以开发利用，用以替代耐药性的抗生素类药物，也将为禽蛋的深度开发提供思路和方向。

4 结论

卵转铁蛋白通过胰蛋白酶酶解获得抗菌肽通过正交试验优化获得最佳条件为：pH 值8.5，温度55 ℃，底物浓度30 mg/mL，酶与底物浓度比1∶300（U/mg），酶解时间1.5 h，该抗菌肽经试验测得最大抑菌率达到89.152%。