H9亚型禽流感病毒毒种保存期试验

梁宛楠

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

禽流感（AI）又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，是由正黏病毒科、流感病毒属A型流感病毒引起的一种急性、败血型传染病，几乎所有野生及家养禽类均可感染。根据禽流感致病性的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感和低致病性禽流感[1]。

本试验将H9禽流病毒TJ株检验和基础种子批冻干毒存放于-70℃保存，并于不同的保存时间抽样随机抽样，进行病毒含量测定、血凝价测定、毒力测定和无菌检验，确定冻干毒种-70℃条件下的保存期；将检验和生产种子批湿毒存放于-20℃保存，并于保存后不同时间随机取出，进行病毒含量测定、血凝价测定、毒力测定和无菌检验，确定湿毒-20℃条件下的保存期。

1 试验材料

1.1 毒种

毒种信息见表1。

表1 毒种信息

1.2 检验用培养基

无菌检验用硫乙醇酸盐培养基（T.G）、酪胨琼脂（G.A）和葡萄糖蛋白胨（G.P），由哈药集团生物疫苗有限公司制备；支原体检验用Frey氏培养基，购自中国兽医药品监察所。

1.3 SPF鸡及SPF鸡胚

由哈药集团生物疫苗有限公司五常SPF鸡场提供。

2 试验方法

将检验和基础种子批冻干毒存放于-70℃保存，并于保存当日和保存后3、6、9、12、18和24个月，随机抽样，分别进行病毒含量测定、血凝价测定、对鸡毒力测定和无菌检验，确定冻干毒种-70℃条件下的保存期；将检验和生产种子批湿毒存放于-20℃保存，并于保存后3、6、9和12个月随机取出，进行病毒含量测定、血凝价测定、毒力测定和无菌检验。

2.1 病毒含量测定

将毒种用生理盐水作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1 mL，置37℃继续孵育，24 h以前死亡的鸡胚弃去不计，在24～96 h死亡的鸡胚随时取出，至96 h，取出所有活胚，分别收获鸡胚液，测定鸡胚液HA效价，HA效价≥1∶16（微量法）者判为感染，按Reed-Muench法计算EID50。

2.2 红细胞凝集效价

按现行《中国兽药典》附录进行测定。

2.3 对鸡的毒力

将毒种用生理盐水稀释至107.0EID50/0.1 mL，静脉注射42和56日龄SPF鸡各5只，0.1 mL·只-1。攻毒后第5天，采集每只鸡的泄殖腔拭子进行病毒分离。将每只鸡的样品经尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚。孵育观察5 d，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液血凝价，以5枚鸡胚中至少有1枚鸡胚的鸡胚液血凝价不低于1∶16（微量法）判为病毒分离阳性。对病毒分离为阴性的样品，应盲传1次，再次测定HA价。记录结果。

2.4 无菌检验

按照现行《中国兽药典》附录进行检验。

3 试验结果

3.1 冻干毒种保存期试验结果

不同保存时间冻干毒种病毒含量及血凝价测定、鸡毒力试验、无菌检验结果见表2～4。

从表2～4结果可以看出，检验种子和基础种子批冻干毒种于-70℃保存24个月，病毒含量和血凝价与保存当日无明显差异，无细菌和霉菌污染；检验用冻干强毒种于-70℃保存24个月与保存当日均可致42和56日龄鸡感染；无细菌和霉菌污染。

3.2 湿毒保存期试验结果

不同保存时间检验和生产毒种湿毒病毒含量测定结果见表5。

表2 病毒含量及血凝价测定结果

表3 对鸡毒力量测定结果

续表

表4 无菌检验结果

续表

由表5可知，检验和生产种子批湿毒于-20℃保存9个月，病毒含量与保存当日无明显差异，保存12个月病毒含量下降1个滴度以上，血凝价为1∶128。

不同保存时间检验用湿毒种对鸡毒力试验结果见表6。

由表6可知，检验种子批湿毒于-20℃保存9个月与保存当日均可致42和56日龄鸡5/5感染，保存12个月仅可致42和56日龄2/5～3/5感染。

不同保存时间毒种湿毒无菌检验测定结果见表7。

由表7可知，检验和生产种子批湿毒于-20℃保存12个月与保存当日均无细菌、霉菌污染。

表5 病毒含量及血凝价测定结果

表6 对鸡毒力量测定结果

表7 湿毒无菌检验结果

4 结论

4.1 H9亚型禽流感病毒

TJ株检验和基础冻干毒种于-70℃保存24个月，病毒含量、血凝价与保存当日无明显变化，且无细菌和霉菌污染；检验用冻干强毒种对鸡的毒力与保存当日无显著差异，无细菌和霉菌污染。

4.2 H9亚型禽流感病毒

TJ株检验和生产种子批湿毒于-20℃保存9个月，病毒含量、对鸡的毒力与保存当日无明显差异，无细菌、霉菌污染；保存12个月病毒含量下降1个滴度以上，检验强毒对鸡的毒力明显下降。因此，将H9亚型禽流感病毒TJ株湿毒-20℃保存的有效期定为6个月。