中草药-微生物合剂祛除肉鸡粪便臭味的试验研究

宇 凌，玄振盈，孙丰超，董翠梅，魏中锋*

（1.山东省菏泽市动物疫病预防控制中心，山东 菏泽 274000；2.泰安市岱岳区祝阳镇兽医站，山东 秦安 271000）

畜禽粪便臭味是饲料中没有彻底消化的营养物质（主要是蛋白质等）产生的，这类营养物质被统称为臭味前提物。本研究通过添加自制的中草药-微生物合剂来提高肉鸡消化功能，以弥补微生物除臭剂的不足，且能增强微生物制剂的除臭效果，从而达到减少臭味前提物产生的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

菏泽市牡丹区水建街农贸市场销售的健康肉鸡。

1.1.2 试验器材

鼓风干燥箱（DHG-9240A，常州诺基仪器有限公司）；调温电炉功率（2000W，宁波江南仪器制造厂）；电子分析天平［AR2140，梅特勒托利仪器（上海）有限公司］；MGC-250型光照培养箱（MGC-250，上海恒科学仪器有限公司）；立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-50KBS，上海申安医疗器械厂）；双目生物显微镜［（Nikon 80i，尼康中国）有限公司］；超净工作台（SW-CJ-2ED，苏净苏洁净化设备有限公司）；真空冷冻干燥机（D-1A-50型，北京博弈康实验仪器有限公司）；超低温冰箱（Thermo Scientific，赛默飞世尔科技中国分公司）；便携式氨气检测仪（GA10，郑州迪凯科技有限公司）；便携式硫化氢检测仪（GD2000-H2S，郑州迪凯科技有限公司）；恒温培养箱（HWS-250，宁波江南仪器制造厂）；真空冷冻干燥机（D-1A-50型，北京博弈康实验仪器有限公司）；双门冰箱，青岛海尔。

1.1.3 试验试剂

槟榔、焦三仙、苍术、陈皮、厚朴、甘草，购自菏泽舜王城药材批发市场；双黄连注射液（170526，山西兆益生物有限公司生产）；氟苯尼考（73231342，郑州后羿制药有限公司）。

1.1.4 基础日粮组成

基础日粮组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平%

1.2 中草药除臭剂的加工方法

中草药制剂药液滤取：按一定比例称取槟榔、焦三仙、苍术、陈皮、厚朴、甘草共计200 g。用1 260 mL蒸馏水浸泡药材50 min，然后先用大火煮沸，再改用文火煎熬30 min，一煎后将其倒入事先准备好的玻璃杯瓶中，再向砂锅中倒入540 mL的蒸馏水准备二煎，大火煮沸后文火煎熬25 min。收集2次煎煮后的药液倒入玻璃瓶中，置于冰箱中密封保存。

中草药制剂可溶性粉的制作流程：将煎熬后的中药分装于5个大型培养皿中，每个培养皿中添加药液200 mL，将其置于超低温冰箱中迅速冰冻。将完全冰冻的中药置于真空冷冻干燥机中进行干燥。冷冻干燥后收集冻干后的中药即为可溶性粉剂。煎熬提取冷冻后共得中草药可溶性粉剂50 g。

1.3 饮水中添加中药除臭剂对鸡舍氨气的影响

试验地点：山东省菏泽市动物疫病预防控制中心实验室。

中草药制剂饲喂肉鸡的处理：肉鸡用氟苯尼考加双黄连注射液连续处理3 d，防止各种敏感菌所致的感染及病毒的侵袭。试验动物的饲养时间为7:00、12:00和17:00。

试验分组：将健康状态良好的80只鸡分为4组，每组20只。各组之间确保不相通，但要确保试验环境、饲料和饮水对试验结果无影响，在各组基础日粮相同的情况下，对照组Ⅰ饮水照常；试验组Ⅱ在饮水中添加中草药制剂0.01%；试验组Ⅲ在饮水中添加中草药0.025%，试验组Ⅳ在饮水中添加中草药0.05%。连续喂养7 d后，采集健康肉鸡分泌物对其氨气进行测定，随机称量肉鸡分泌物30 g置于100 mL锥形瓶内，同时测定其氨气浓度并记录数据，测定后立即用保鲜膜密封保存。置于37℃恒温恒湿箱内培养。间隔12 h测定1次，连续测定60 h并记录实验数据。

1.4 中草药制剂与除臭菌的关系

通过试验筛选确定了两种微生物可以有效祛除肉鸡粪便臭味，通过检测公司测序鉴定这两种微生物为：巨大芽孢杆菌和鞘氨醇单胞菌。

为了保证除臭菌能在中草药制剂环境中正常生长繁殖，并探索出二者最佳的比例，组成微生物-中药除臭合剂，进行如下研究。

1.4.1 中草药制剂可溶性粉对除臭菌生长的影响试验

将制取的中草药可溶性粉加入配制好的营养琼脂里，制成培养基，接种两种除臭菌，于37℃培养箱中培养20 h，观察两种菌的生长情况[1-3]。

1.4.2 中草药制剂可溶性粉与筛选确定的除臭菌可溶性粉的添加量的研究

为了探索出自制中草药可溶性粉及之前经试验筛选并鉴定的除臭菌巨大芽孢杆菌和鞘氨醇单胞菌可溶性粉合理的添加比，设10个试验组，每组20只鸡。每组鸡采食相同的日粮，仅饮水中添加不同剂量的自制中草药可溶性粉和除臭菌合剂可溶性粉。具体分组情况见表2。

表2 除臭菌合剂、自制中草药可溶性粉的不同添加量%

1.4.3 自制中草药制剂可溶性粉与除臭菌合剂不同添加量降氨效果

饮水中添加中草药可溶性粉、除臭菌合剂可溶性粉后7 d后，采集鸡粪放置到锥形瓶中，每间隔12 h测定1次鸡粪中氨气浓度，以此结果确定微生物-中药除臭合剂最佳的组方。

1.5 微生物-中药除臭合剂的效果研究

试验分组：为进一步确定微生物和中药除臭剂的最佳组合，检验微生物-中药除臭合剂的除臭效果及其氨除臭的机理，对以下4组的鸡粪中氨气、有机氮、铵态氮、硝态氮含量的进行了测定，分组见表3。

表3 粪中氨气、有机氮、铵态氮、硝态氮含量的测定分组%

粪中有机氮、铵态氮、硝态氮含量的测定方法：在饮水饲喂微生物-中药除臭合剂10 d后，从第11天的8:00开始计时，于0、24、48、72和96 h收集对照组与组合1的鸡粪，鸡粪按固液比1∶5加入一定量的超纯水，摇匀，在温度为0℃、转速为150 r·min-1的条件下振荡浸提1 h，吸取2 mL原液于离心管中，在4℃的低温条件下，以12 000 r·min-1的速度离心20 min，收集上清液。取50.0 mL粪样上清液备用，分别利用凯氏定氮法、靛酚蓝法、酚二磺酸法测定鸡粪中有机氮、铵态氮、硝态氮的含量[4-6]。

2 试验结果

2.1 饮水中添加中药除臭剂对鸡舍氨气影响测定试验各组鸡舍氨气测定试验结果

在不同时间对各组鸡粪中的氨气进行测定得到的氨气产生量，见表4。

表4 鸡粪氨气试验测定结果mg·L-1

由表4可知，随着鸡饮水中添加自制中草药可溶性粉剂的量的增加，鸡粪中氨气的含量呈下降趋势。试验组Ⅱ的降氨效果比试验组Ⅰ显著有效，但试验组Ⅲ的降氨效果差异不显著。因此，中草药可溶性粉除臭剂剂的最佳添加量为0.025%。

2.2 中草药制剂对除臭菌生长的影响试验结果

中草药制剂对两种除臭菌生长的影响分别见图1与图2，两图上面3个培养皿为对照组，下面3个为试验组。

图1 自制中草药可溶性粉对巨大芽孢杆菌生长的影响

图2 自制中草药可溶性粉对鞘氨醇单胞菌生长的影响

由图1与图2可知，巨大芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌在含自制中草药可溶性粉的培养基上长势更好，菌落形态更大。说明自制中草药可溶性粉对巨大芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌的生长繁殖不仅没有副作用，而且有促进作用。

2.3 自制中草药制剂可溶性粉与除臭菌合剂不同添加量降氨效果试验结果

降氨效果结果见表5。

表5 添加不同量的中草药可溶性粉、除臭菌合剂粉剂后的氨气浓度ppm·L-1

由表5可知，试验组Ⅴ与对照组、试验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ（除36 h氨气浓度外）差异极显著（P＜0.01），与试验组Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ差异不显著（P＞0.05）。试验组Ⅴ与试验组Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ4组差异不显著（P＞0.05），但从成本角度考虑，Ⅸ组由于微生物与中药用量均大成本较高，被淘汰出局。

2.4 微生物-中药除臭合剂的效果研究

2.4.1 粪中氨气、有机氮、铵态氮、硝态氮含量的测定结果

通过表6比较发现，试验组1效果最好，应为最佳组合。

2.4.2 测定结果比较

测定结果比较见图3，通过饮水饲喂微生物（0.2%）-中药（0.05%）除臭合剂后，鸡粪中有机氮含量显著低于对照组（图3A，P＜0.05）；新鲜鸡粪中铵态氮含量升高，24 h后铵态氮含量显著下降（图3B，P＜0.05）；硝态氮含量则明显高于对照组（图3C，P＜0.05）。饲喂微生物（0.2%）-中药（0.05%）除臭合剂，可显著降低鸡粪中有机氮含量（A，P＜0.05），新鲜鸡粪中铵态氮含量升高，24 h后铵态氮含量明显下降（B，P＜0.05），提高硝态氮含量（C，P＜0.05）。

表6 饲喂除臭菌合剂后，氨气的测定结果 ppm·L-1

图3 鸡粪中有机氮、铵态氮、硝态氮的含量变化

3 讨论

3.1 微生物-中药除臭合剂的最佳剂量

由表6可知，4个试验组6个时间点氨气量均比对照组低。试验组1在每个时间点氨气含量均低于对照组和其他3个试验组。试验组1为微生物-中药除臭合剂为除臭菌可溶性粉0.2%加中草药可溶性粉0.05%，为最佳组合剂量。

因此，通过以上研究确定，微生物-中药除臭合剂量为：0.2%除臭菌可溶性粉加0.05%自制中草药可溶性粉，其中除臭菌合剂中微生物的最佳组合为巨大芽孢杆菌1.5×106cfu·mL-1、鞘氨醇单胞菌0.6×106cfu·mL-1。

3.2 自制微生物-中药除臭合剂的效果

饲喂自制微生物-中药除臭合剂后，我们测定了各组鸡粪中有机氮、铵态氮和硝态氮的含量。最佳组合剂量组，即饲喂微生物-中药除臭合剂0.25%后，鸡粪中有机氮含量明显低于对照组（P＜0.05）；新鲜鸡粪中铵态氮含量略高于对照组，24 h后铵态氮含量显著下降（P＜0.05）；硝态氮含量则明显高于对照组（P＜0.05)。表明自制微生物-中药除臭合剂的最佳剂量可以有效降低鸡粪臭味。

3.3 微生物-中药除臭合剂的除臭机理

试验结果表明，微生物-中药除臭合剂很可能在肠道的厌氧环境中，利用或促进其他微生物利用有机氮作为氮源，将有机氮转化成铵态氮，使鸡粪中有机氮含量显著下降。

中草药饲料添加剂对畜禽消化、循环系统及内分泌系统性能具有明显的影响[7]。本研究方中的焦三仙（山楂、麦芽和神曲）有健脾胃、舒肝化滞等功效，含多种酶类和维生素，可以调节肠道功能，消除肠道病菌，有助于提高胰液的分泌量，同时增加蛋白质总量和淀粉酶活性，促进食物的消化和消化系统吸收，有助于提高畜禽的食欲[8]。苍术具有祛湿健脾之功效，促进气血运行陈皮具有缓解腹胀、脾胃气滞等症状的功效[9-10]。甘草有类似肾上腺皮质激素样作用，可抑制胃酸分泌过多，并有抗酸和缓解胃肠平滑肌痉挛作用[11]。槟榔具有杀虫、破积、降气行滞、行水化湿的功效[12]。厚朴具有行气化湿、温中止痛、降逆平喘的功效，对葡萄球菌、链球菌、赤痢杆菌、巴氏杆菌、霍乱弧菌有较强的抗菌作用[13]。中草药可调节胃液和消化酶的分泌，增强机体对食物的消化吸收，从而增加了肉鸡对含氮化合物和含硫化合物的消化吸收，进而提高了微生物除臭剂对肉鸡粪便的除臭效果。

在鸡粪堆积过程中，铵态氮含量下降，可能的原因是随着有机氮含量的减少，铵态氮的生成减少；也可能是微生物-中药除臭合剂自身或促进其他微生物生长繁殖过程中利用了大量的铵态氮作为氮源，将铵态氮转化为硝态氮，使24 h后鸡粪中铵态氮含量明显下降（P＜0.05），硝态氮含量显著升高（P＜0.05）。结果表明，饮水中添加筛选的除臭微生物在鸡肠道的厌氧环境中可利用或促进其他微生物利用有机氮和铵态氮（NH4+-N）作为氮源，使鸡粪中有机氮和铵态氮含量显著降低，并将铵态氮转化为亚硝酸盐（NO2--N）；在体外的有氧环境中可将亚硝酸根转化为硝酸根（NO3--N），有效降低鸡粪中氨气的产生，从而达到降氨除臭的效果。