工业三七药渣中三七素的提取纯化及其止血药理活性研究

李 双，杨晓涵，李怀宇，陈丽玲，刘艳红，王华晶，秦华炎，陈 彤*

1昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，昆明 650500；2四川省凉山州中西医结合医院， 凉山 615000；3大理护理职业学院，大理 671006；4昆明医科大学临床技能中心，昆明 650500

三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen为五加科人参属植物，是我国珍贵的中药材[1]。道地产地是云南文山。三七的有效成分包括皂苷、三七素、黄酮、聚炔醇、多糖、脂肪酸以及环肽类等[2]。但目前对三七有效成分的研究利用主要集中在皂苷成分[3,4]。每年用于提取三七总皂苷的三七约为1400吨，三七总皂苷的工业提取工艺：取三七碎成粗粉，用70%的乙醇提取，滤过[1]。三七总皂苷提取后，目前大多药企把提取过三七总皂苷的三七药渣请环保单位当成废渣处理，少数企业将三七药渣压成板用作生物燃料，这对名贵中药三七是一种浪费。

日本学者小菅卓夫等[5]首次从三七根中分离并鉴定了三七的主要止血活性成分是一种特殊的水溶性非蛋白质氨基氨基酸即三七素，化学名为β-草氨酸-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diamino-propionic acid，简称β-ODAP)，分子式为C5H8N2O5，相对分子质量为176.13。参照有关文献报道，目前对于分离三七素主要采用柱色谱的方法，鲁岐等[6]采用Sephadex LH-20凝胶柱和CM Sephadex C-25凝胶离子交换柱，谢国祥[7]等用001×7阳离子交换树脂柱，贾伟[8]等用D001型离子交换树脂柱，谭朝阳[9]等用732强酸型阳离子交换树脂和CM Sephadex C-25凝胶离子交换柱，但上述三七素均是从三七中提取纯化得到。

图1 三七素的化学结构Fig.1 Chemical structure of dencichine

本课题以提取过三七总皂苷的工业三七药渣为原料，考察工业三七药渣中是否含有三七素并进行分离纯化，测定三七素供试品的含量，考察三七素供试品的止血药理活性。本课题有利于三七资源的综合利用。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2030型HPLC色谱仪(日本岛津)，DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)，RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，LabconcoR4.5L冷冻干燥机(美国Labconco公司)，BSA224S型万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，TDZ4台式低速离心机(湖南郝西仪器装备有限公司)，5210HP型超声波清洗机(上海科导仪器有限公司)。

1.2 试药

工业三七药渣(云南云科药业有限公司提供)，001×7阳离子交换树脂(艾美科健生物医药有限公司)，硅胶板(青岛海洋化工厂)，三七素标准品(上海纯优生物科技，纯度>98%)，茚三酮、氯化钠、无水乙醇、冰醋酸(天津市大茂化学试剂厂)，氨水(成都市科龙化工试剂厂)，正丁醇(西陇化工有限公司)，丙酮(重庆川东化工有限公司)，甲醇，乙腈均为色谱纯，0.9%生理盐水，酚磺乙胺注射液(天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司，2 mL:0.5 g)。

1.3 动物

SPF级昆明种小鼠(购于昆明医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(滇)K2015-0002)，雌性，6周龄，体重20±2 g，25只。

2 方法与结果

2.1 三七素的提取

取工业三七药渣1 kg，加6倍量重量的蒸馏水在50 ℃的恒温水浴锅中浸提8 h，收集滤液，滤渣加3倍量重量的蒸馏水提取8 h，收集滤液，合并两次滤液。以4 500 rpm，离心5 min，倾倒上清液，抽滤，得滤液，将滤液置于旋转蒸发仪，50 ℃旋转浓缩至原体积的1/9，加入3倍量乙醇，边加边搅拌，4 ℃下静置24 h，抽滤；将滤液置于旋转蒸发仪，50 ℃回收乙醇，得粗提液约100 mL。

2.2 三七素的分离与纯化

2.2.1 001×7阳离子交换树脂纯化三七素

取粗提液30 mL，经001 × 7阳离子交换树脂柱纯化(3 cm × 30 cm)，流速为0.2 mL/min，先用水洗脱，以除去色素等杂质，至洗脱液为无色；再用0.1 mol/L氨水洗脱，收集洗脱液，每管10 mL，茚三酮显色，至洗脱液不显紫色，结束洗脱。

2.2.2 三七素的薄层鉴别(确证三七药渣中是否含有三七素)

将显色的各管洗脱液与三七素对照品各10 μL在硅胶板上点样，展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶乙醇∶水( 4∶1∶1∶2 )，茚三酮溶液为显色剂(110 ℃ 显色5 min)，观察是否有与三七素对照品相同Rf值及颜色的斑点。

2.2.3 丙酮结晶

合并与三七素对照品斑点有相同Rf值及颜色且只有这一个斑点的洗脱液。合并液于50 ℃的旋转蒸发仪浓缩蒸干，加适量水使其全部溶解，倒至烧杯中，加入30倍量的丙酮，边加边搅拌，析出大量沉淀，过0.2 μm滤膜，沉淀用少量水溶解；所得水溶液继续用同样的方法再次结晶；将重结晶溶于水，进行薄层检测验证，结果仅有一个斑点且与三七素对照品有相同Rf值和颜色，将重结晶水溶液冷冻干燥，得三七素供试品，备用。

2.3 三七素供试品的含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS2 (250 mm × 4.6 mm，5 μm )；流动相：溶剂A∶溶剂B(95∶5，v∶v)，溶剂A为0.001 %的醋酸溶液，溶剂B为乙腈∶甲醇∶水(45∶10∶45,v∶v∶v)的混合溶液；流速1.0 mL/min，检测波长：214 nm，柱温为30 ℃，进样量为20 μL。

图2 三七素色谱图Fig.2 Chromatogram of dencichin注：A：三七素标准品；B：三七素供试品。Note:A:Standard of dencichine;B:Test product dencichine.

因三七素水溶性好，反相高效液相出峰时间短，三七素粗提物、树脂纯化和结晶各阶段高效液相色谱图见图3：各阶段高效液相色谱证实了工业三七药渣中含有三七素，并证实三七素在分离纯化的各个步骤中存在。

图3 三七素色谱图Fig.3 Chromatogram of dencichin注：A：三七素标准品；B：三七素粗提液；C：树脂柱层析后溶液；D：三七素供试品。Note:A:Standard of dencichine;B:Crude decichine extract;C:Dencichine solution obtained by chromatograohy separation with cation exchange resin;D:Test product dencichine.

2.3.2 对照品溶液的配制

精密称取三七素对照品2.5 mg，置25 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。临用前用0.2 μm微孔滤膜过滤。

2.3.3 供试品溶液的配制

精密称取供试品2.5 mg，置25 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。临用前用0.2 μm微孔滤膜过滤。

2.3.4 标准曲线的制备

精密吸取对照品储备液适量，用流动相配制成浓度分别为20、40、60、80、100 μg/mL的对照品溶液，摇匀，依次进样，按上述色谱条件测定，以三七素对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。得回归方程A=1 867.6C-24 814，r2=0.999 26，结果表明三七素对照品浓度在20～100 μg/mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.5 仪器精密度试验

精密吸取浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液，按照2.3.1中色谱条件进样，连续进样6次，记录峰面积，峰面积依次为167 461、170 647、168 729、170 984、166 467、169 710，RSD为1.06%，结果表明，用于本品的检测仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验

精密称取同一批号供试品6份，按照2.3.3中“供试品溶液的制备”方法操作，制备6份供试品溶液，分别进样，记录峰面积，峰面积依次为96 412、97 984、95 118、97 555、96 098、96 275，RSD为1.08%，结果表明，此方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10 h进样测定，记录峰面积，峰面积依次为96 424、95 984、96 118、97 357、96 288、96 325。RSD为0.51%，结果表明，本供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.3.8 加样回收率试验

精密量取待测样品6份，按照2.3.3中“供试品溶液的制备”方法操作，分别加入三七素对照品(对照品浓度为0.1 mg/mL)0.4 mL，即加入0.04 mg三七素，进样，测定峰面积，计算回收率。结果表明，本方法加样回收率良好。

表1 三七素供试品加样回收率试验结果

2.3.9 含量测定

称取供试品2.5 mg，按照3.3.3中供试品溶液的制备供试液3份，进样20 μL，计算三七素的含量。

表2 三七素供试品中三七素的含量测定结果(n=3)

2.4 三七素供试品的凝血实验

2.4.1 玻片法测定凝血时间

取昆明种小鼠25只，随机分为5组，每组5只，分别用苦味酸标记。组别分别为生理盐水组(阴性对照组)、酚磺乙胺注射液组(阳性对照组，25 mg/mL)、三七素粗提液注射液组(27 mg/mL)、三七氨基酸注射液组(9.4 mg/mL)、三七素粗品低浓度组(1.6 mg/mL)、三七素粗品中浓度组(3.2 mg/mL)、三七素粗品高浓度组(6.4 mg/mL)。腹腔注射给药，剂量为10 mL/kg。30 min后用眼科弯镊迅速摘去小鼠一侧眼球，即有血液流出。将血滴至干净的载玻片上，血滴直径约为5 mm，滴血同时用秒表计时，每隔10 s用清洁针头自血滴边缘向里轻轻挑动1次，观察有无血丝挑起，记录凝血时间。从采血开始到挑起血丝止，所历时间为凝血时间。采用SPSS统计学软件中的单因素方差分析法对各组凝血时间进行比较。

2.4.2 结果

三七素供试品对小鼠凝血时间的影响，如下表所示：

三七素供试品高、中、低剂量组与生理盐水组比较，能显著缩短凝血时间(P<0.01)。三七素供试品高、中、低剂量组与酚磺乙胺注射液组比较，能显著缩短凝血时间(P<0.01)。

表3 七素供试品对小鼠凝血时间的影响

注：与生理盐水组相比，*P<0.05,**P<0.01；与环磷酰胺组比较，ΔP<0.05,Δ ΔP<0.01。

Note:Compared with saline group,*P<0.05,**P< 0.01;Compared with Etamsylate group,ΔP<0.05,Δ ΔP<0.01.

3 结论

工业三七药渣要经过用70%的乙醇，高温数次提取，有些还要调节pH值，药渣最后用蒸汽吹干，后晒干。而三七素极易溶于水且遇热遇酸碱不稳定，工业三七药渣是否含有三七素是本课题能否进行的关键。

在HPLC检测过程中，参照已有文献[13-16]，考察了不同的流动相，甲醇：水(70∶30)、乙腈：0.05%磷酸溶液(5∶95)、乙腈：水(80∶20)等，根据色谱图分离效果，确定流动相为溶剂A∶溶剂B(95∶5，v∶v)，溶剂A为0.001%的醋酸溶液，溶剂B为乙腈∶甲醇∶水(45∶10∶45,v∶v∶v)的混合溶液。所建立的高效液相色谱法测定三七素含量，方法简单，结果准确。因三七素水溶性好，反相高效液相出峰时间短，三七素粗提物、树脂纯化和结晶各阶段高效液相色谱图见图3：各阶段高效液相色谱证实了工业三七药渣中含有三七素，并证实三七素在分离纯化的各个步骤中存在。

目前文献报道的三七素的分离纯化方法[11]用到凝胶色谱柱Sephadex LH-20和CM SephadexC-25，但Sephadex LH-20和CM SephadexC-25价格昂贵，成本较高，不适合大工业生产所用。而本实验参照文献[12]采用价格低廉的001×7阳离子交换树脂柱分离纯化三七素，此方法简单易行，成本低廉，适合大工业生产，但文献[12]中以三七为原料，先用乙醇沉淀、正丁醇萃取除去皂苷成分再进行分离纯化，而本实验以提取过三七总皂苷后的工业药渣为原料，在工业药渣中加入纯化水提取，提取液浓缩后加乙醇沉淀多糖等物质，皂苷已提取，不需要正丁醇萃取除去皂苷，将上清液过001 × 7阳离子交换树脂柱分离纯化，成本低廉，适合于大工业生产。

本实验最初将所得三七素供试品水溶液于50 ℃下烘干并进行了薄层鉴别，薄层鉴别未发现与对照品有相同斑点，推测三七素受热不稳定。后将三七素供试品水溶液采用真空冷冻干燥技术进行干燥，冻干产品薄层鉴别结果证实与对照品有相同斑点。考虑三七素是一个受热不稳定的物质，所以干燥过程要采用真空冷冻干燥技术。

据报道[10]三七中三七素的含量为0.5%～0.9%，故直接从三七中提取三七素成本较高。三七道地产地云南文山常年种植面积达到了12万亩左右，产量9 000 吨。本实验采用水提醇沉法从提取过三七总皂苷的工业三七药渣中提取三七素，经001 × 7阳离子树脂柱纯化、丙酮结晶、冷冻干燥得三七素供试品，高效液相色谱法测定三七素含量为59.03%，反推到三七药渣中，三七素含量为0.72%，每年用于提取三七皂苷的三七约为1400 吨，皂苷提取后，每年从工业三七药渣中弃去的三七素近3吨。药理实验证实：三七素供试品能明显缩短凝血时间，具有良好的应用前景，可用于止血药物、医疗器械及日化产品的研发。本课题的研究有利于三七资源的综合利用。