拐枣中总黄酮提取工艺优化及其抗黄嘌呤氧化酶活性研究

许洪波，李 铂，唐志书，李 圆，冀 春,2，刘乃尧,2，吴群军，王 薇

1陕西中医药大学陕西省中药资源产业化协同创新中心；2陕西中医药大学药学院，咸阳 712083；3旬阳太极缘生物科技有限公司，安康 725741

拐枣，又名万寿果，为鼠李科枳椇属枳椇(Hoveniaacerba)的膨大果序轴(肉质果柄)，其上所产种子即为中药枳椇子[1]。拐枣中含有丰富的维生素、有机酸、氨基酸、糖苷等，是药食两用物品；入药可用于消渴、解烦止呕等[1,2]。此外，拐枣还具有重要的经济价值，是饮料、制醋、酿酒的常用原料[3]。现代化学、药理学及工艺研究多集中在枳椇子方面[4-8]，很少涉及肉质果柄。

我们前期研究表明，拐枣的50%乙醇提取物对黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)具有明显的抑制作用，其IC50为82.46 ± 5.39 μg/mL；这也是我们首次发现拐枣具有此活性。化学成分预试实验提示，该部位主要含有黄酮类化合物。为了阐明该部位体外抗XO的活性物质，本研究选取拐枣为研究对象，首先采用响应面法优化其总黄酮的提取工艺，并在此基础上进一步富集纯化，最后评价所得总黄酮抑制XO的活性；研究结果以期为拐枣食品和天然药物开发利用提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

拐枣收集于陕西安康旬阳县，经陕西中医药大学王薇教授鉴定为鼠李科枳椇属枳椇(HoveniaacerbaLindl.)的肉质果柄(带少量果实)。芦丁对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，纯度以98.0%计，批号：wkq16101104)；黄嘌呤氧化酶、黄嘌呤、别嘌呤醇购自成都西亚化工股份有限公司，EDTA-2Na、KH2PO4、K2HPO4和甲醇、乙醇等试剂均为分析纯。

1.2 仪器

UV-2600 紫外可见分光光度计(日本岛津)，EYELA N-1100旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社)，HH-2 型电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)，FW-1000AD 型快速开盖高速万能粉碎机(天津鑫博得仪器有限公司)，CPA2250型电子天平(赛多利斯公司，读数精度0.01 mg)，KQ-300 DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。全波长酶标仪(Multiskan GO,Thermo Scientific,USA)。

2 实验方法

2.1 样品前处理

拐枣样品放置于鼓风干燥箱内，50 ℃条件下干燥至恒重，取出适当粉碎后保存备用。

2.2 标准曲线的绘制

总黄酮含量的测定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法，以芦丁为对照品。具体步骤如下：精密称定20 mg芦丁对照品于100 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液稀释并定容至刻度线，摇匀，即得浓度为0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液。精确吸取对照品溶液0.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL于25 mL容量瓶中，加入5% NaNO溶液1.0 mL，摇匀后静置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液1.0 mL，放置6 min，加入10% NaOH溶液10.0 mL，再加60%乙醇溶液定容至刻度线，摇匀后放置15 min。在510 nm处测定各浓度样品吸光度，以芦丁浓度(C)和吸光度(A)分别为横、纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程为：A=5.811 4C+ 0.094 2(R2=0.999 3)，表明所测黄酮在0.02～0.18 mg/mL质量浓度范围内与吸光度有良好的线性关系。

2.3 单因素试验

准确称取10 g干燥的拐枣粉末，浸泡0.5 h后，在设定的实验条件下(考察提取次数、料液比、乙醇浓度和提取时间四个因素)回流提取，将提取液过滤，(合并)滤液浓缩至约50 mL，转移至100 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，摇匀作为样品溶液。精密吸取1.0 mL样品溶液，转移至10 mL 容量瓶中，再用60% 乙醇定容至刻度，摇匀，按照标准曲线绘制方法操作，测定吸光度，根据标准曲线计算出测定稀释后样品溶液总黄酮浓度C。然后计算样品中总黄酮的提取率，总黄酮提取率计算公式如下：

提取率(%)=[黄酮的质量浓度(mg/mL)×稀释倍数×最初溶液体积(mL)×10-1]/原料质量(g)

2.4 响应面实验

在单因素实验的基础上，选取料液比(A)、提取时间(B)和乙醇浓度(C)为考察因素，以总黄酮提取率为响应值，根据Box-Benhnken 实验设计原理，采用三因素三水平的响应面实验表，用Design Expert 8.0进行试验数据分析，最后通过模型验证确认总黄酮最佳提取条件。Box-Benhnken试验设计因素及水平见表1。

表1 响应面分析因素及水平表

2.5 总黄酮的富集纯化

将经最优工艺提取的提取液，减压浓缩至无醇味，吸附于适量处理过的D101大孔树脂色谱柱(10 × 80 cm2)中，先用30%乙醇洗脱至颜色变浅，然后用体积分数70%的乙醇洗脱液进行洗脱，直到流出的洗脱液颜色明显变浅，将该部分洗脱液收集，浓缩即得纯化的拐枣总黄酮。

2.6 抑制黄嘌呤氧化酶活性测试

实验所用的缓冲溶液、底物溶液、酶液配置参照前期建立的方法[9]，活性测试方法及步骤简述如下：

精密称取拐枣总黄酮适量，用缓冲液溶解备用，活性测试使用酶标仪，溶液总体积为100 μL，反应时先依次向96孔板加入样品20 μL，酶液40 μL，在酶标仪内37摄氏度孵育三分钟，之后加入底物黄嘌呤40 μL，启动反应，立即在295 nm处记录吸收度值(每隔30 s一次)，共计5 min。本实验设置样品组(加样品、底物和酶)、酶组(加底物和酶但不加样品)、空白组(只加底物和样品不加酶)和阳性对照组(别嘌呤醇)。抑制率(%)用下列公式计算：抑制率(%)=(ΔA酶-ΔA样品)/(ΔA酶-ΔA空白)×100。其中ΔA指一定时间内吸光度的差值。

3 结果与讨论

3.1 单因素试验

3.1.1 提取次数对提取率的影响

称取样品10 g，设定乙醇浓度60%，料液比1∶20，提取时间2 h，考察提取次数(1、2、3、4 次)对总黄酮提取率的影响。由于朱新鹏[10]等研究表明，拐枣总黄酮在温度大于80 ℃时，稳定性较差，因此，本研究固定提取温度为80 ℃。实验结果表明(图1A)，提取次数越多提取率越大，但提取2次后提取率增加不明显。考虑到时间和经济成本，选取提取次数为2次。

3.1.2 料液比对提取率的影响

称取样品10 g，固定乙醇浓度60%，提取温度80 ℃，回流提取两次，每次提取2 h，考察料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30时对提取率的影响。结果如图1B 所示，随着提取溶剂量的增加，黄酮提取率呈现先快速增长而后下降的趋势。增加提取溶剂用量，可以使物料与溶剂充分接触，同时可以使更多的物质溶解于溶液中，从而有助于提升总黄酮的提取率。但本试验结果表明，当料液比超过1∶15 g/mL时，总黄酮提取率趋于平缓，超过1∶20 g/mL时反而有所下降，这可能是由于溶剂过多，在热回流作用下，拐枣中非黄酮类成分大量溶出，影响了总黄酮的得率。考虑到溶剂成本，选择1∶15 g /mL为适宜料液比。

3.1.3 乙醇浓度对提取率的影响

取样品10 g，分别以40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液为提取溶剂，料液比1∶20，回流提取两次，每次2 h，提取温度为80 ℃，考察乙醇浓度对拐枣总黄酮提取率的影响。结果如图1C 所示，提取率随乙醇浓度递增呈先增加后减少的变化趋势，在乙醇浓度为50%左右时，总黄酮的提取率较好。这可能的原因是：黄酮类化合物在植物中通常以苷的形式存在，我们推测拐枣中黄酮苷类物质较多，因此，50%左右的乙醇提取效果较好，随着乙醇浓度增大，一些醇溶性杂质成分溶出量增加，反而导致黄酮类化合物的提取率下降。

3.1.4 提取时间对提取率的影响

取样品10 g，设定乙醇浓度60%，回流提取两次，提取温度80 ℃，每次分别回流提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，考察提取时间对总黄酮提取率的影响。图1D 显示提取时间在1～1.5 h之间，提取时间对拐枣总黄酮提取率的总体影响不大，提取时间超过2 h后提取率反而减少了。这可能是提取时间增长，一方面某些黄酮类化合物可能发生结构变化，另一方面可能因为随着提取时间的增长，植物细胞中的粘液等杂质溶出使提取液粘度增大，影响提取率。

图1 提取次数(A)、料液比(B)、乙醇浓度(C)及提取时间(D)对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effects of number of extractions (A),solid-to-liquid ratio (B),ethanol concentration (C) and extraction time (D) on the yield of total flavonoids

3.2 响应面设计试验结果及分析

在单因素试验基础上，固定提取次数和提取温度，以料液比(A)、乙醇浓度(B)、提取时间(C)为自变量，以总黄酮提取率为响应值，设计17次试验，其中析因部分试验12次，中心点重复试验5次，结果见表2。试验以随机次序进行，利用Design Expert 8软件对数据进行多元回归拟合，得到总黄酮提取率Y的函数:Y=2.52 + 0.016A- 0.13B+ 0.30C+ 0.027AB- 0.050AC+ 0.087BC- 0.33A2- 0.20B2- 0.51C2。

模型中一次项B和C，二次项A2、B2和C2的P值均小于0.01，交互项BC的P值小于0.05，说明提取时间、乙醇浓度、提取时间的交互项以及3个因素的二次项都具有显著影响；而其他交互项和料液比的显著性较差，表明实验因素对响应值不是简单的线性关系，而是一种非线性关系[11]。

响应曲面坡度越陡峭，表明响应值对于操作条件的改变越敏感，反之曲面坡度越平缓，操作条件的改变对响应值的影响也就越小。图2直观的反映了各因素对响应值的影响程度，乙醇浓度对拐枣总黄酮提取率的影响最为显著，表现为曲线较陡，其次为提取时间和料液比，表现为曲线较平缓。

表2 响应面试验设计及结果

表3 回归方程的方差分析

注:**P< 0.01为极显著;*P< 0.05为显著。

Note:**P< 0.01,indicates extremely significant difference;*P< 0.05,indicates significant difference.

图2 各提取因素之间的交互影响Fig.2 Response surface plots showing the mutual effects of different factors on the yield of flavones

3.3 最佳工艺条件及验证试验

用Design Expert 8软件对二次多项式回归方程进行计算，得到最佳的提取条件为：料液比为14.96 mL/g、提取时间1.86 h、乙醇浓度52.76%，预测提取率为2.58%。但考虑到实际操作和生产的局限性，将提取工艺调整为∶料液比为15.0 mL/g、提取时间1.85 h、乙醇浓度53.0%。根据此条件并在浸泡0.5 h，提取温度80 ℃，提取2次条件下进行了3次平行验证实验，得到拐枣总黄酮的平均提取率为2.56%，相对标准偏差为1.74%，表明试验重复性良好。验证结果与模型的预测值接近，表明此响应面法得到的回归模型具有较好的可靠性。

3.4 拐枣总黄酮的进一步富集纯化

上述工艺优化所得的物质其实是含有拐枣总黄酮的提取物，优化的目的只是使总黄酮尽可能的提取出来，但其在提取物中的含量比较低；因此，我们需要进一步富集纯化，得到含量较高的拐枣总黄酮，以进行后续研究。

经过2.5项下方法富集纯化后，拐枣提取物总黄酮纯度达到63.15%。

3.5 体外抑制黄嘌呤氧化酶活性测试

黄嘌呤氧化酶是一种可催化次黄嘌呤和黄嘌呤生成尿酸的蛋白酶[12]。正常人体中XO活性被调控在正常水平，但体内代谢紊乱，就可能导致XO活性过高，会使体内尿酸生成增加，进而导致高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)[13,14]。HUA不仅与痛风密切相关，而且是代谢性疾病(糖尿病、代谢综合征、高脂血症等)、心血管疾病、慢性肾病、脑卒中等的独立危险因素[15]。临床上通过抑制黄嘌呤氧化酶活性，从而减少尿酸生成是治疗HUA 的重要途径之一。但临床上使用的黄嘌呤氧化酶抑制剂(xanthine oxidase inhibitors,XOI)主要有两个，即别嘌呤醇(allopurinol)和非布司他(febuxostat)，它们虽然可明显降低血尿酸水平，但也有存在较多副作用和局限性。目前，由于中药具有多成分，多靶点，低毒、有效等特点，因此从中药中寻找天然XOI具有特殊的优势。

我们前期对拐枣的50%乙醇提取物进行了活性筛选，首次发现拐枣50%乙醇提取物具有明显的抗XO活性，其IC50为82.46 ± 5.39 μg/mL。本研究在此基础上，主要考察拐枣总黄酮在体外对XO的抑制作用。活性试验采用前期构建的活性测试方法[9]，测试了拐枣总黄酮在6.25、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL浓度时对XO的抑制作用(图3)，结果表明拐枣总黄酮在25 μg/mL时即对XO有明显抑制，抑制率为(75.36 ± 3.97)%；经GraphPad Prism 5 软件计算其IC50为18.63 ± 1.67 μg/mL，阳性对照别嘌醇的IC50为7.24 ± 0.33 μg/mL。活性研究结果表明，黄酮类成分可能是拐枣50%乙醇提取物中具有抗XO活性的物质。

图3 拐枣总黄酮抑制黄嘌呤氧化酶的量效关系曲线Fig.3 The dose-effect relationship curve for total flavonoids of Hovenia acerba inhibiting XO

4 结论

本研究利用响应面法设计优化拐枣总黄酮的提取工艺，得到最佳工艺条件为：料液比为15.0 mL/g、提取时间1.85 h、乙醇浓度53.0%，在此条件下预测提取率为2.58%，实际提取率为2.56%，理论值与实际值相符，表明试验可靠。本模型可用于拐枣黄酮的提取制备，可为拐枣黄酮的工业化、规模化开发利用提供参考。

体外抗XO活性结果表明，拐枣总黄酮具有显著的抗XO活性，其IC50为18.63 ± 1.67 μg/mL，活性研究结果提示，拐枣黄酮可能是拐枣50%乙醇提取物中具有抗XO活性的物质。本研究可为从拐枣中寻找和发现天然抗XO活性分子提供参考，同时可为拐枣的开发利用提供思路。