线粒体DNA在非小细胞肺癌中的研究进展

白翠青 左志通 陈宝华 宋 勇

研究认为肿瘤的生物学特性不仅与细胞核内遗传物质有关，而且与细胞核外的遗传物质即线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)有关。越来越多的研究发现多种恶性肿瘤中存在mtDNA的变异，包括非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)、膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌等，并且发现mtDNA的变异与这些肿瘤的发生发展密切相关。本文对mtDNA在非小细胞肺癌中的研究进展做一综述。

一、mtDNA

1. mtDNA的结构和特点： 线粒体是真核细胞进行氧化磷酸化产生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的细胞器，其与能量代谢、细胞凋亡、氧化应激等生物学活动密切相关，它拥有独立于细胞核基因组之外的遗传物质即mtDNA[1]。人类mtDNA由16 569个核苷酸对组成，呈双链闭合环状，包含一条轻链和一条重链，大部分编码基因位于重链上，负责编码12个线粒体呼吸链酶复合物结构亚基、12S及16S线粒体核糖体RNA (ribosomal RNAs, rRNAs)和14个线粒体转运RNA( transfer RNAs, tRNAs)，轻链仅编码8种tRNA和1种线粒体呼吸链酶复合物结构亚基[2-4]。mtDNA呈母系遗传，线粒体内蛋白质的合成受mtDNA控制，在编码区，几乎每一个碱基都在基因的拼接过程中起着重要作用[5]，因此编码区一旦有基因突变，mtDNA的序列就会发生改变，进而导致mtDNA编码蛋白的改变，线粒体功能紊乱，最终导致人体致病。人体大多数细胞包含103～104拷贝数的mtDNA，与核DNA (nuclear DNA, nDNA)相比，mtDNA缺乏组蛋白保护、位置靠近线粒体内膜易受活性氧 (reactive oxygen species, ROS)损伤、损伤修复能力低，因此突变率比nDNA高[4]。高拷贝数、高突变率是mtDNA区别于nDNA的两大主要特点。在mtDNA的16024-576bp之间有一个1124bp长的非编码区又称之为D环(displacement loop, D-loop)，占全部mtDNA的6%左右，包含调控mtDNA重链、轻链转录和复制的因子[6]。D-loop区是一个包含2条轻链和1条重链的3链结构，富含A-T碱基，在这个区有2个超高变异率区(high-variable regions, HV:HV1，位于16024-16383；HV2位于57-372)，其碱基替换率比其他区域高5～10倍，绝大多数突变发生在此区，被称为热点[7]。突变mtDNA的数目达到一定程度可引起某些组织或器官的功能异常。

2. mtDNA与疾病： 人类mtDNA已经被全部测序，线粒体编码基因也已经确认。在一些神经退行性疾病、婴儿猝死综合征中都发现了mtDNA的变异。在实体肿瘤和血液肿瘤中也都发现了mtDNA变异，可能原因为mtDNA变异导致线粒体的功能障碍和细胞易感性，进而导致肿瘤发生[8]。mtDNA变异包括mtDNA拷贝数的变化和mtDNA的基因突变。研究表明mtDNA变异不仅与肿瘤的发生发展相关，而且与治疗的敏感性相关[9-11]。

二、NSCLC中mtDNA拷贝数的变化

mtDNA拷贝数是指mtDNA在线粒体基因组中的个数，每个线粒体约含有2～10个mtDNA拷贝数，正常人体每个体细胞mtDNA拷贝数为103～104，不同组织类型中mtDNA的拷贝数不同。 线粒体功能的发挥与线粒体中mtDNA的拷贝数密切相关。研究表明不同类型的肿瘤，mtDNA拷贝数的变化不同。

1. mtDNA拷贝数发生变异的可能机制： 一方面mtDNA D环区的调节因子发生变异时，mtDNA的复制和转录可能会发生改变，进而导致mtDNA拷贝数下降；另一方面，高水平的ROS导致氧化损伤因子8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine, 8-oxo-G)产生，同时8羟-基鸟嘌呤DNA糖苷酶1灭活和DNA聚合酶γ缺乏导致mtDNA损伤修复失败，mtDNA拷贝数改变，ROS介导的损伤补偿机制也会影响mtDNA拷贝数[12]。

2. NSCLC中mtDNA拷贝数的变化特点及与NSCLC风险的关系： 研究发现，与癌旁组织相比，肺癌患者癌组织中mtDNA拷贝数显著下，且与D-loop区突变相关[13-14]。大多数肿瘤其肿瘤组织的mtDNA拷贝数相对于癌旁正常组织是下降的，但是肺腺癌组织相对于癌旁正常组织mtDNA拷贝数是增加的[15]。由此推测NSCLC组织中mtDNA拷贝数可能与组织类型有一定关系，需要更多临床试验去证实。有研究对云南宣威地区的肺癌患者进行了病例对照研究，入选122例原发性肺癌患者和122例对照组患者，分别收集其晨起痰液，从痰液中提取mtDNA进行定量RT-PCR分析，发现mtDNA含量>157拷贝数的患者肺癌风险是拷贝数<157拷贝数患者的2倍，提示mtDNA拷贝数与肺癌风险呈正相关，并且发现这种关系仅限于大于57岁的高龄患者[16]。Hosgood 等[17]对来自芬兰的227例肺癌患者和227例对照患者进行了一项前瞻性队列研，对研究组和对照组全血中的mtDNA进行荧光定量PCR分析，也发现mtDNA高拷贝数与肺癌风险相关，并且呈剂量依赖性关系，尤其在重度吸烟患者中更明显。然而一项前列腺癌、肺癌、大肠癌、卵巢癌筛查试验(prostate lung colorectal and ovarian, PLCO)和一项上海市区非吸烟女性肺癌危险因素的研究(Shanghai Women′s Health Study, SWHS)均发现mtDNA拷贝数与肺癌风险无关[18-19]。Kim等[20]对合并了三项关于mtDNA拷贝数与肺癌风险的研究进行分析，结果仍发现mtDNA的拷贝数与肺癌风险无关。Meng等[21]进行了一项前瞻性的病例对照研究，纳入463对病例对照组，分析外周血白细胞mtDNA拷贝数与肺癌风险的关系，发现重度吸烟患者mtDNA拷贝数比从不吸烟者更低，且发现在吸烟患者中，中等mtDNA拷贝数组的患者肺癌风险为高拷贝数组的2倍，但在低拷贝数组未发现肺癌风险。由此可见NSCLC中存在mtDNA拷贝数的变化，但是其增高还是降低以及拷贝数变化与肺癌风险的关系目前仍有争议，可能与样本量少、mtDNA来源不同、对照不同等相关，需要更大样本量、更统一标准的研究去探索。

3. mtDNA拷贝数是NSCLC潜在的无创辅助诊断手段： 目前液体活检已在临床有应用，比如通过测定血液中循环游离nDNA的浓度，可初步鉴别良恶性疾病。相对于nDNA，mtDNA具有长度较短、分子结构简单、拷贝数大等特点，更易于检测，因此是潜在的肿瘤早期检测分子标志物。Hou等[22]在一个小样本量的临床试验中发现，NSCLC患者的血清mtDNA水平与良性肺部疾病及健康人群相比显著升高，并且发现与TNM分期密切相关，晚期NSCLC患者血清的mtDNA水平较早期患者显著升高，但血清mtDNA水平与患者的性别、年龄、组织病理学类型、淋巴结转移无关，ROC曲线(receiver operating characteristic, ROC)发现血清mtDNA水平可用来鉴别良恶性肺部疾病，其临界值为 0.74×104拷贝数/μl ，敏感性和特异性分别为86.2%和80.7%，这说明血清mtDNA是NSCLC的一个潜在无创性的分子标志物，但需要更多更大样本量的临床试验支持。

4. mtDNA拷贝数与NSCLC的治疗效果及预后的关系： Lin等[23]对29例N2阳性Ⅲ期新辅助化疗NSCLC患者的术后肺癌组织mtDNA拷贝数进行回顾性分析，发现mtDNA拷贝数降低与化疗后疾病进展有关，可能的机制为mtDNA拷贝数降低，提示线粒体密度降低，进而ROS产生减少，ROS诱导的细胞分化和凋亡功能减弱，进而促进肿瘤进展。 Huang等[24]在一个小样本量的给予厄洛替尼治疗的肺腺癌患者中测定其治疗前后外周血中的游离mtDNA浓度，并且评估了血浆mtDNA的潜在预后价值，结果发现疾病进展或者是对厄洛替尼无效的患者外周血中mtDNA浓度较治疗前显著降低，部分缓解的患者外周血mtDNA浓度与治疗前相似或升高，外周血mtDNA浓度与疾病无进展生存期无关，肿瘤EGFR的突变状态也与外周血mtDNA无关。对厄洛替尼治疗有效的患者，其治疗后外周血mtDNA浓度较前升高的可能原因为厄洛替尼破坏了肿瘤细胞，从而释放大量mtDNA到外周血。由此表明治疗后肿瘤组织或血清中的mtDNA拷贝数降低可提示治疗疗无效或疾病进展，而mtDNA拷贝数升高则提示治疗有效。Xu等[25]对128例NSCLC患者进行研究，其mtDNA从手术标本中分离，发现高拷贝数mtDNA的患者中位OS为34.1个月，而低拷贝mtDNA患者的OS为27.9个月，两者具有统计学差异，这表明高拷贝数mtDNA的患者预后比低拷贝数mtDNA患者的预后好，低mtDNA拷贝数是NSCLC预后差的一个因素。由此可见，mtDNA拷贝数在评估NSCLC治疗效果及预后方面有一定作用。

三、NSCLC中mtDNA的突变

1. mtDNA突变与肿瘤发生的可能机制： 目前普遍认为mtDNA突变参与肿瘤形成，但其确切机制尚不明确。目前认为可能的机制有：一方面，mtDNA突变达到一定程度，可直接或间接引起线粒体呼吸链功能障碍，细胞内能量减少，细胞和组织缺少生物学能量而不能维持正常的功能进而导致细胞癌变，肿瘤生成；同时线粒体是内源性ROS产生的主要来源，mtDNA突变后ROS产生增加，线粒体氧化应激增加，诱导细胞癌变[26]。另一方面，线粒体通过调节电化学梯度诱导细胞凋亡，mtDNA突变引起电化学梯度增高，线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mtPTP)关闭，阻止了程序性细胞死亡因子的释放，导致肿瘤细胞抗拒凋亡[27-28]。

2. NSCLC中mtDNA的突变特点： 研究表明在许多肿瘤中存在D-loop区mtDNA的突变，这些突变包括303-309位点均聚物C片段( homopolymeric C tract, PCT)数目的变化和单一的碱基置换(single base substitutions, SBS)。在手术切除的NSCLC中，D-loop区SBS频率是7～29%，PCT改变是16%[29]。Suzuki[6]等对28个肺癌细胞系和55例手术切除的NSCLC组织进行D-loop区测序，发现29%的细胞系有SBS，并且是同质性的，50%的细胞系有PCT改变，8个细胞系是同质的，95%的SBS出现在D-loop区的高突变区，在55例手术切除的NSCLC组织中，20%有PCT改变。Matsuyama[30]等研究了202例NSCLC患者的病理标本，发现70例NSCLC患者的肿瘤细胞mtDNA在D-loop区有各种突变，其中16117A-T和16368A-T突变率最高，并且突变与性别、年龄、吸烟指数、组织类型等无关，ⅢB期和T3以上分级的患者突变率更高。Jin等[31]对55例肺癌患者的外周血mtDNA进行分析，发现60%的患者外周血mtDNA存在突变，共发现56例突变，包括48例点突变、4例单核苷酸插入突变、4例单核苷酸缺失突变，同时也与上述研究相一致，发现mtDNA突变与性别、年龄、吸烟史、肿瘤类型、肿瘤分期等无明显关系。与此相反， Dasgupta等[32]分别对30例从不吸烟和目前吸烟的肺癌患者进行研究，发现与当前吸烟的患者相比，从不吸烟患者的mtDNA突变率更高，并且发现在从不吸烟的患者中，mtDNA的突变显著与EGFR(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突变相关，具有EGFR基因突变者的mtDNA突变率更高。Kazdal等[33]分析了352例NSCLC的mtDNA突变和突变的空间分布，发现了456种不同的mtDNA突变，这些突变随机分布在整个mtDNA基因上，重复率很低，突变频率最高的是G16390A，占1.7%，说明mtDNA突变在NSCLC中可能仅仅是乘客突变，而不是驱动突变，这对mtDNA相关的靶向治疗产生了挑战。

3. mtDNA突变与NSCLC风险及预后的关系： mtDNA单倍型类群是发生特异性变异的mtDNA，Zheng等[34]对422例肺癌患者进行病例对照研究，发现单倍型类群D和F是肺癌的保护性因素，单倍型G和M7是肺癌的危险因素，并且发现相对于对照组肺癌患者的mtDNA 822缺失频率更高，多变量分析发现吸烟是mtDNA 822缺失的危险因素。Wang等[35]对250例韩国的NSCLC研究，发现单倍体(D/D4)与早期NSCLC的OS差相关。 Matsuyama等[36]研究了202例NSCLC患者，发现70例NSCLC患者的肿瘤细胞mtDNA在D-loop区有各种突变，在ⅢB期和Ⅳ期的患者中，有突变的相对于未突变的预后更差。研究发现mtDNA的D-环区单核苷酸多态性位点235A/G和324A/G与NSCLC风险增加有关，并且发现等位基因16390是NSCLC预后的独立因素，等位基因为16390A的患者OS比16390G的患者短[37-38]。Koshikawa等[39]在一个小样本量的NSCLC临床标本中测定线粒体NADH脱氢酶亚基基因，发现线粒体NADH脱氢酶亚基基因的突变可导致线粒体复合体Ⅰ活性下降，并且发现其突变率与NSCLC的远处转移显著相关。Qi等[40]在一个小样本量的手术切除的NSCLC组织标本中发现高水平的mtDNA10398G突变组患者的预后较低水平突变组的预后好，高水平突变组的平均OS为28.7个月，而低水平突变组OS为22.5个月，两组有统计学差异，表明低水平的mtDNA10398G突变变是NSCLC预后差的一个因素。一个小样本量研究发现高拷贝数mtDNA同时有10398G突变的患者中位OS为47.3个月，而低拷贝数且10398A突变的患者中位OS为26.3个月，两者具有统计学差异，这表明低mtDNA拷贝数和10398A突变是NSCLC预后差的因素。可能的原因为mtDNA拷贝数降低和10398突变导致mtDNA功能紊乱，从而影响肿瘤的生物学行为以及影响治疗的敏感性，进而导致预后差。

上述研究表明NSCLC中存在mtDNA突变，但尚未发现特异性的突变，且突变频率及突变的的相关影响因素，mtDNA突变与NSCLC风险和预后的关系尚无统一结论，尚需更多的研究去完善。

四、mtDNA与NSCLC的治疗

最近研究表明在未来靶向线粒体是治疗肺癌的有效手段。肺癌细胞很大程度上依赖线粒体呼吸功能，一些研究表明抑制线粒体功能是治疗肺癌的一项有效措施。使用线粒体抑制剂后肺癌细胞会对药物敏感，而且会使肿瘤细胞缺少ATP而处于饥饿状态，影响肿瘤的生长和转移,而健康细胞的氧化磷酸化水平较低，对能量的需求水平低，所以不会受影响。一些线粒体抑制剂如环巴胺酒石酸盐、二甲双胍、microRNA-126、BAY 87-2243可以通过一定的分子机制干扰肿瘤细胞的线粒体功能，进而抑制肿瘤[41]。而上调mtDNA和生物合成基因则与肺癌发病相关。目前靶向基因治疗的临床研究绝大多数集中于nDNA，在一些细胞水平或动物实验中有靶向mtDNA的研究。BAY 87-2243 是一种有效的选择性的缺氧诱导因子-1 (hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)抑制剂，体外细胞实验表明BAY 87-2243可通过抑制线粒体复合体I进而抑制HIF-1的活化，从而抑制NSCLC细胞系H460的增殖[42]。Szczesny等[43]体外实验发现mtDNA的修复需要硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)调节，抑制H2S的合成可以通过抑制mtDNA的修复使肺腺癌细胞对化疗药物敏感。Trivedi等[44]将包含有microRNA-34a的透明质酸纳米粒转入到A549肺腺癌细胞的线粒体中，发现成功转入后，细胞的ATP水平发生了改变，糖酵解、核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2) 、谷胱甘肽等的水平降低了，最终导致半胱氨酸酶激活，肿瘤细胞凋亡，其潜在的分子机制为导入的microRNA-34a改变了mtDNA D环区的基因状态和编码区的基因转录进而导致上述改变。

综上所述，在NSCLC中存在mtDNA拷贝数和基因的变异，提示mtDNA的变异可能在NSCLC的发生发展过程中存在一定作用，但具体作用机制及是否能将mtDNA作为诊断NSCLC的分子标志物以及其与临床预后的关系、治疗需要更深入的探索。